UBA III – Biologia Molecular Aula prática 2 2014/2015 Maria José Correia mariacorrei@gmail.com
Eletroforese em gel de agarose Sumário P2: Eletroforese em gel de agarose Vizualização do DNA isolado na aula anterior em geis de agarose. 16/10/2014
Eletroforese em gel de agarose Separação de diferentes fragmentos de DNA em função da sua mobilidade num campo elétrico Fatores que influenciam a migração de DNA em gel Peso molecular Conformação do DNA Concentração de agarose Voltagem aplicada Composição do tampão de eletroforese http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/eletroforese.php 16/10/2014 3
Eletroforese: preparação do gel de agarose Preparar uma solução de agarose em tampão TAE (1x) com concentração final de 1% (m/v). Aquecer a mistura em microondas até toda a agarose se ter dissolvido. Montar o suporte do gel na respetiva base de preparação do gel. Colocar o pente formador de poços na posição correta. Verter a agarose no suporte eliminando bolhas de ar que se tenham formado e deixar solidificar à temperatura ambiente. Retirar o pente cuidadosamente para não danificar os poços. Colocar o suporte na tina de eletroforese, de modo a que os poços estejam do lado do elétrodo negativo, e adicionar tampão TAE(1x) 16/10/2014 4
Electroforese: preparação das amostras Adicionar tampão de carga amostras de DNA de cada um isoladas na aula anterior. Aplicar as amostras nos respetivos poços com uma micropipeta, evitando a contaminação dos poços adjacentes. Reservar um dos poços para aplicar marcador de pesos moleculares (para referência) Colocar a tampa na tina e verificar se a migração das amostras se dá no sentido cátodo-ânodo (preto-vermelho). Estabelecer a corrida a 100V durante 30 minutos. Depois da corrida, desligar a tina e retirar o gel e colocá-lo numa tina com corante. Lavar o gel com água (40-55ºC) Examinar os resultados. 16/10/2014 5