Montagem e análise de genomas UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA BIO 796 – Bioinformática Montagem e análise de genomas Janaina O. Melo

Sequenciamento de genomas Genoma: conjunto de toda informação hereditária de um organismo codificada no DNA (ou RNA, em alguns vírus). Inclui tanto genes como seqüências não codificantes Sequenciamento de genomas: geralmente feito utilizando a estratégia de shotgun Montagem “in silico’’ das seqüências Identificação de genes, ORFs, análises filogenéticas, etc Construção de bibliotecas genômicas: Vetores que propagam grandes insertos, como BACs, por exemplo Esses insertos precisam ser fragmentados, pois os métodos de sequenciamento geram leituras de aproximadamente 500-800 pb.

genoma Fragmentação Inserção em vetores de alta capacidade Cosmídeo, BAC, plasmídeo, etc. Inserção em vetores de alta capacidade Nova fragmentação actgactgactgactgactgactactgactgactgactgactgactactgactgactgactgactgactgactgact actgactgactgactgactgact Montagem dos contigs plasmídeo C A T G Clonagem em plasmídeos e sequenciamento

Montagem de “contigs” de seqüências (clusters) :

Estratégias de bioinformática para montagem (assembly) dos contigs VNTI ContigExpress (http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=10209) TIGR DNAMAN SeqMan CAP3 - Web Contig Assembly Program (http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php) Phred/Phrap/Consed

CAP3 - Web Contig Assembly Program Copiar as seqüências em formato fasta para o programa CAP3 CAP3: visualizar os contigs e as seqüências únicas, ver detalhes dos contigs e obter suas seqüências Pode-se fazer uma busca no banco de dados utilizando o BLAST

Phred/Phrap/Consed Pacote de programas para: Leitura de cromatogramas Atribuição de qualidade a cada base Mascaramento de vetores Montagem de seqüências Visualização e edição dos contigs

Phred: Programa que lê os arquivos dos cromatogramas, atribui uma base a cada pico e valores de qualidade às bases. A qualidade Phred corresponde a um inteiro entre 0 e 99 e está associada à probabilidade de erro de leitura. Uma base com qualidade 40 indica que o erro é 10-4, ou seja 1 erro a cada 10.000 bases. Desse modo, quanto maior o Phred maior a qualidade do sequenciamento.

É um programa para montagem das seqüências. Phrap: É um programa para montagem das seqüências. Gera várias informações sobre os contigs, contidas em path/edit_dir: phrap.out, *.ace and *.screen.contigs.qual files Uma quantidade enorme de seqüências podem ser manipuladas Gera dados importantes e permite a visualização gráfica por outros programas.

Consed: Programa para visualização e edição dos alinhamentos produzidos pelo Phrap.

Abrir o consed

Abrir os contigs

Pesquisar seqüências específicas

Selecionar um contig (não há diferença entre letras maiúsculas e minúsculas na busca)

Menu Navigate: Regiões de baixa qualidade Discrepância na qualidade das seqüências Regiões cobertas por somente uma fita Pesquisa por ORFs

Percorrer o alinhamento

Regiões de baixa qualidade

Busca por ORFs

Menu Misc: Tradução da seqüência consenso em aminoácidos

Qualidade de uma base

Verificação da qualidade da base Cor/significado 0 – 4 Cinza escuro 5 – 9 Cinza 10 – 14 Cinza claro ... 40 – 97 Branco 99 O usuário editou a base e a caracterizou com certeza absoluta 98 O usuário editou a base, mas não a caracterizou com certeza absoluta

Visualizar o cromatograma e editar as bases

Obter informação do contig

Busca de ORFs na sequência ORF Finder: http://bioinformatics.org/sms/orf_find.html GENSCAN: http://genes.mit.edu/GENSCAN.html

Obrigada!