Obtenção de Cultivares Transgênicas Grupo 4: Filipi Rodrigues Nathalia Brancalleão Renata Rebellato Linhares Tarcísio Vasconcelos

Início Seleção de sementes das melhores plantas e de seus cruzamentos espontâneos 1983 - primeira planta transgênica com gene codificante para a resistência contra o antibiótico canamicina introduzido em plantas de fumo

Transformação genética Inserção direta de um gene de interesse Genes da própria espécie, de outras espécies ou sintéticos

Métodos de transformação Agrobacterium tumefaciens Bombardeamento

Ferramentas essenciais Conhecimento da Cultura Bioinformática Clonagem Microbiologia Definição do método de transformação Cultura de tecidos vegetais Biologia molecular

Bioinformática Definição do gene de interesse Estudo dos sítios de restrição Desenho de primers

Clonagem – Agrobacterium tumefaciens Inserção do gene em vetores de expressão Adição de promotores Inserção dos vetores

Gene Escolhido – npr1 isoforma 7

PCR

Clonagem inicial – vetor de clonagem Fácil inserção do gene Genes de seleção

Produto inicial

Inserção do vetor na bactéria – E. coli Crescimento bacteriano Seleção de colônias transformadas Replicação do DNA Avaliação da inserção por digestão enzimática

Avaliação enzimática 1

Inserção no vetor intermediário

Inserção do vetor na bactéria – E. coli Crescimento bacteriano Seleção de colônias transformadas Replicação do DNA Avaliação da inserção por digestão enzimática

Avaliação enzimática 2

Inserção no vetor final

Inserção do vetor na bactéria – E. coli Crescimento bacteriano Seleção de colônias transformadas Replicação do DNA Avaliação da inserção por digestão enzimática

Avaliação enzimática 3

Inserção do vetor final em A. tumefaciens Via eletroporação Choque térmico Sequenciamento

Transformação genética Escolha de explantes Protocolo de regeneração Uso de reguladores vegetais para regeneração de plantas Regenerar a célula transformada em uma planta completa transformada

Via A. tumefaciens Contato entre explante e A. tumefaciens transformada.

Co-cultivo Cultura conjunta por poucos dias de planta e bactéria, sem antibióticos – disco foliares

Bombardeamento Partículas de ouro ou tungstênio recobertas pelo vetor de transformação Vetor de aproximadamente 15Kb Bombardeador de alta pressão de gás Helio

Seleção Cultivo em meio com antibiótico Canamicina Cefotaxima Seleção de brotações adventícias transformadas Cefotaxima Eliminação de A. tumefaciens

Regeneração

Regeneração

Regeneração

Aclimatização

Avaliação Expressão transiente PCR Southern Blot Western Blot qPCR RT-PCR

Expressão transiente

PCR

Obrigado