ESPECTROSCOPIA NA LUZ VISÍVEL E ULTRAVIOLETA Alice Machado Lemos Aline Paiva Noble Hecson Jesser Segat Isabel Daronco Alexandre Lauren Pappis Letícia Teixeira Nunes Louise Vignoles Neves

ESPECTROSCOPIA NA LUZ VISÍVEL E ULTRAVIOLETA Introdução:  Método aplicado na determinação de compostos inorgânicos e orgânicos, como por exemplo: identificação de princípios de fármacos e também na determinação da concentração dos mesmos.  As amostras analisadas podem estar em qualquer estado físico.

A região do espectro do ultravioleta é na faixa de 200 a 400 nm e a da luz visível é entre 400 e 800 nm.

Espectroscopia de Absorção É preciso determinar a quantidade de luz que a amostra irá absorver, sendo descrito pela Lei de Beer-Lambert que é a relação entre a intensidade da luz incidida na solução (I0) e a intensidade da luz saindo da solução (I). -log (I/Io) = A = cl A = absorbância  = absorvidade molecular ou coeficiente de extinção c = concentração do material absorvedor l = espessura da amostra através da qual a luz passa

Desvios da Lei de Beer-Lambert Desvios Químicos:  Deslocamento do equilíbrio: quando uma amostra se dissocia, associa ou reage com um solvente para formar um produto que tem espectro de absorção diferente da amostra.  Dissociação de complexos: excesso ou insuficiência de agente complexante.

Desvios da Lei de Beer-Lambert Desvios Instrumentais: em soluções muito concentradas, as moléculas do soluto influenciam umas às outras devido às suas proximidades, pois quando ficam muito perto umas das outras, a absortividade pode mudar um pouco.

A absorção na região da luz depende da estrutura eletrônica da molécula. Na região do ultravioleta produz modificações da energia eletrônica da molécula em consequência de transições dos elétrons de valência. Estas transições fazem com que o elétrons excitado passe do orbital molecular ocupado para o primeiro orbital de energia superior.

Espectrofotômetro Instrumento que registra dados de absorbância em função do comprimento de onda (λ). A característica mais importante do espectrofotômetro é a seleção de radiações monocromáticas. O espectro de absorção é característico para cada espécie química, sendo possível a identificação de uma espécie química através do seu espectro de absorção.

Esquema dos principais componentes de um espectrofotômetro A amostra deve estar em um recipiente (cubeta) de quartzo quando a radiação for na região espectral do ultravioleta. Quando for na região da luz visível usa-se os de vidro por ter uma melhor dispersão. Os detectores devem ser altamente sensíveis. Os dados obtidos pelo detector são enviados para um dispositivo de processamento de dados.

Fontes de Radiação As fontes mais comuns baseiam-se na incandescência, mas devem atuar em temperaturas elevadas para ter uma cobertura apreciável no ultravioleta. São constituídas por filamentos de materiais que são excitados por descargas elétricas com elevada voltagem ou aquecimento elétrico.

Fontes de Radiação Condições para uma fonte ser de boa qualidade para atuar nessa faixa:  gerar radiação contínua;  ter intensidade de potência radiante suficiente para permitir a sua detecção pelo sistema detector;  ser estável. Além disso deve ter um tempo de vida longo e preço baixo.

Exemplos de Fontes de Exemplos de Fontes de Radiação Lâmpada de filamento de tungstênio; Lâmpada de quartzo-iodo; Lâmpada de descarga de hidrogênio ou de deutério; Lâmpada de cátodo oco e Laser

Monocromadores Função: seleção do comprimento de onda em que se tem interesse para a análise. Constituição:  fenda de entrada de um elemento de dispersão de radiação  fenda de saída Tipos:  prismático  reticuladores

Monocromador Prismático A radiação policromática vinda da fonte de radiação passa pela fenda de entrada e incide sobre a face de um prisma, sofrendo um desvio. Os vários comprimentos de onda terão diferentes direções após a incidência no prisma. Se for realizado um ajuste rigorosamente controlado da fenda de saída, pode-se selecionar o comprimento de onda desejado.

Monocromador Prismático

Monocromador Reticular O principal elemento dispersante é a rede de difração. Essa rede consiste em uma placa transparente ou refletora com muitas ranhuras paralelas e equidistantes. Dispersão resultante desta rede é linear. Os vários comprimentos de onda dispersos são igualmente espaçados, por isso a fenda de saída isolará uma banda de radiação de largura constante. A resolução é muito mais elevado que os prismas.

Monocromador Reticular

Tipos de Espectrofotômetros para a Região Visível e Ultravioleta Espectrofotômetro mono-feixe :

Etapas: 1º) Coloca-se o solvente (branco) no caminho ótico e mede-se a intensidade da energia radiante,que atinge o detector; 2º) Substitui-se o recipiente com o solvente (branco) pelo recipiente com a amostra e faz- se a determinação propriamente dita da absorbância.

Espectrofotômetros mono-feixe: - Não são cômodos pois a amostra e o branco tem que ser colocados alternadamente no único feixe de radiação; - Não é adequado para medir absorbâncias em função do tempo;

Espectrofotômetro mono-feixe

Espectrofotômetro mono-feixe

Espectrofotômetro duplo-feixe Dois feixes de radiação são formados no espaço, por um espelho que divide o feixe vindo do monocromador em dois. Um feixe passa através da solução referencia (branco) até o transdutor e outro, ao mesmo tempo, passa através da amostra até o segundo transdutor. As duas correntes serão determinadas e mostradas no indicador de sinal. Com o auxílio de um dispositivo apropriado, calcula-se a diferença de transmitância entre os dois feixes, essa diferença será mostrada no indicador de sinal como absorvância

Espectrofotômetro duplo-feixe

Espectrofotômetro duplo-feixe

Procedimentos Analíticos em Espectrofotometria Visível em Ultravioleta Análise Qualitativa: dependendo de quanto de luz que a amostra absorver vai determinar qual é a espécie, pois o espectro é característico daquela determinada espécie química.

Procedimentos Analíticos em Espectrofotometria Visível em Ultravioleta Análise Quantitativa: dependendo da absorbância irá determinar a concentração da amostra. A condição especial para qualquer determinação quantitativa é a observação à Lei de Beer-Lambert, mas o controle do pH, as técnicas de extração por solventes, o ajuste do estado de oxidação, entre outras também são muito importantes.

Espectro de Proteínas Espectro é bastante característico. São influenciados pelo meio local: dependem de fenômenos elétricos. Mostra a quantidade de hélice- e folha- Caso a proteína seja desnaturada, a espectroscopia será diferente.

Espectro de Ácidos Nucleicos Tem a absorbância menor que a soma das absorbâncias dos nucleotídeos individuais hipocromicidade e ocorre devido ao empilhamento ou alinhamento dos planos paralelos das bases. Se ocorrer um acréscimo na absorção hipercromicidade. Serve para determinar se estão estruturados.

Fluorescência e Fosforescência Fluorescência é a emissão de luz associada com elétrons que se movem de um estado excitado para o estado fundamental. Fosforescência é a capacidade que uma espécie química tem de emitir luz. Importante porque algumas substâncias quando sujeitas às radiações ultravioleta emitem luz visível. As duas são frequentemente muito mais úteis para se estudar processos biológicos do que a absorbância, por serem consideravelmente mais sensíveis, podendo, então, detectar concentrações bastante baixas.

Automação nos Métodos Espectrofotométricos – Utilização Os laboratórios que utilizam atualmente esse método tem se automatizado com a aplicação da computação, informação, robótica, eletrônica e tecnologia da engenharia mecânica, com o intuito de reduzir os erros nas análises. Além disso, as análises são complementadas por outros métodos para se ter o máximo de certeza possível.

Motivos para o desenvolvimento desses processos Preencher as necessidades dos laboratórios de análises clínicas, surgidas com o crescente número de análises. Aumento do número de espécies químicas a serem determinadas no sangue como análise de rotina Além da necessidade de diminuir o custo dessas análises.

Vantagens dos métodos instrumentais automatizados Maior velocidade no processamento das análises; Maior confiabilidade dos resultados; Diminuição das contaminações; Diminuição na geração de resíduos Menor consumo de amostras e reagentes Redução de custos