NANOPARTICULAS POLIMERICAS PREPARAÇÃO E APLICAÇÃO AULA 5 QP-434-2007

Introdução Liberação Controlada de Fármacos Liberação de fármacos a uma velocidade e/ou numa localização indicada para a necessidade do corpo ou estado da doença em um período especificado de tempo: Liberação temporal: controle sobre a velocidade da liberação do fármaco Liberação espacial: controle sobre a localização do fármaco Hamid Ghandehari in <hghandeh@rx.umaryland.edu >

Introdução Liberação espacial TUMOR = Molécula do fármaco LIBERAÇÃO EXCLUSIVA DO FÁRMACO A TIPOS ESPECÍFICOS DE CÉLULAS Hamid Ghandehari in <hghandeh@rx.umaryland.edu>.

Tempo/dosagem administrada Introdução Liberação temporal P L s m a l e v Convencional Liberação ordem zero Efeitos adversos Níveis tóxicos Faixa terapéutica Concentração Min. efetiva Sem efeito Tempo/dosagem administrada

Sistema de Liberação Controlada O comportamento do fármaco in vivo pode ser mudado drasticamente ao incorpora-lo num carregador. Os veículos de liberação de fármacos coloidais podem prover: Liberação lenta de compostos as vezes tóxicos Habilidade de guiar uma distribuição sistêmica Habilidade de proteger fármacos de degradação ambiental Habilidade de direcionar a alvos específicos diretamente em tecidos Sistemas coloidais em uso são: Nanopartículas d<1mm Microesferas d>1mm Emulsões 100nm<d<5mm Lipossomas 20nm<d<2mm

Micro/nanoesferas e capsulas NANOPARTICULAS NANOESFERAS Monoliticas Reservatorio NANOCAPSULAS Adapted of Lambert,G. Oligonucleotide and Nanoparticles Page, <http://perso.clubinternet.fr/ajetudes/nano/index. html> dez/ 2003.

METODOS DE PREPARAÇÃO 1- Através de polimerização de monômeros Problemas: obtidas induzindo-se a polimerização. Difícil controle da extensão da reação-massa molar não controlada. Purificação posterior. Interação do polímero com o ativo. 2- Diretamente da macromolécula ou polímero pré-formado.

Polímeros biodegradaveis C O (CH2)5 n O CH2 C n Poli(acido glicolico) ou PGA Poli (-caprolactona) ou PCL O CH C n CH3 Poli(acido lactico) ou PLA Poly(3-hydroxybutyrate-co-valerate) or PHBV

BIOPOLÍMEROS TÍPICOS Polímeros biodegradáveis e bioabsorvíveis; Degradação depende de: MM, estrutura, solubilidade,composição da cadeia,grau de cristalinidade. (PLGA)

EMULSIFICAÇÃO/EVAPORAÇÃO DE SOLVENTE Trata-se de um método simples, de fácil transposição de escala e cuja realização em condições assépticas garante a esterilidade final do produto. Em linhas gerais o polímero é dissolvido em solvente volátil em água, como CHCl3 ou CH2Cl2. Se dispersa em água por emulsificação com temnsoativo apropriado. Algumas revisões: Couvreur et al. Eur. J. Pharm. 41, 2 (1995); Alonso. Nanoparticulate drug carrier technology. In Cohgen (Ed). Microparticuate Systems for the delivery of proteins and Vaccines. M. Dekkrt, N.Y. 2996, p. 203; Soppomath et al., J. Control. Rel. 70, 1 (2001).

MÉTODOS MAIS IMPORTANTES DE PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS Maria I. Rê e M.F.A. Rodrigues-IPT-2004 1-MÉTODO DE EMULSIFICAÇÃO/EVAPORAÇÃO DE SOLVENTE FASE AQUOSA Água destilada Tensoativo FASE ORGÂNICA Solvente orgânico Homogenizaçào Polímero Sonicação Agente ativo EMULSÃO Óleo em água Extração do solvente Evaporação do solvente SUSPENSÃO DE NANOPARTÍCULAS Sanchez et al. Int. J. Pharm. 99, 263 (1993); Zambaux et al. J. Control. Rel. 50, 31 (1998); Verrechia et al., J. Biom. Mater. Res. 27, 1019 (1993) Após a formação da nanoemulsão, o solvente se difunde para a fase externa (extração para a fase aquosa) até saturação da mesma. Com a evaporação das moléculas do solvente que atingem a interfase fase aquosa-ar, reestabelece-se o gradiente de concentração, ou seja, a força motriz para a difusão do solvente orgânico das nanogotas para a fase aquosa. Ao ser eliminado o solvente, o polímero precipita levando a formação das nanoesferas.

Evaporação de solvente modificado (nanoesferas). PREPARAÇÃO Evaporação de solvente modificado (nanoesferas). 2 solventes solúveis entre si (um é não-solvente para o polímero) SEI, 22.000x, 20 kV, topografia Laboratório - Preparação: 10% (surfatante), 0,8% (polímero), 40%etanol/acetona SEI, 2.300 x, 20 kV, topografia

APLICAÇÃO 1- Formação de nanoesferas para substâncias lipofílicas. Este método tem sido modificado para uma emulsão múltipla do tipo água/óleo/água. 2- Limitações: a) Emulsão óleo/água deve ter uma fase dispersa (óleo) bastante fina e homogênea (requer bastante tensoativo e técnicas de agitação elevada). b) Solventes orgânicos (clorados) e tensoativos usados (álcool polivinílico, p.ex.) não são compatíveis com aplicações biológicas. 3- Alternativas: Uso de tensoativos como albumina de soro humano . 4- Propriedades otimizadas: diâmetro médio e distribuição de tamanho; re-suspensão num veículo aquoso sem agregação; teor de fármaco; taxa de liberação, taxa de degradação; esterilidade; apirogenecidade; e teor de solvente residual. 5- Variáveis: Volume da fase aquosa para a fase orgânica; concentração do polímero na fase orgânica; concentração do fármaco na fase orgânica; presença de tensoativo em ambas fases (orgânica e aquosa); solubilidade do fármaco na fase aquosa (nível de saturação); método e velocidade de agitação.

-2-MÉTODO DE EMULSIFICAÇÃO ESPONTÂNEA/DIFUSÃO DE SOLVENTE (Niwa et al. J. Pharm. Biopharm. 25, 89 91993). Um solvente miscível em água (acetona, etanol ou metanol) é misturado ao solvente immiscível (CHCl3, ou CH2Cl2). A difusão espontânea do solvente miscívil no meio aquoso cria uma turbulência interfacial entre as duas fases levando a formação de partículas menores. Fase aquosa Fase orgânica Difusão rápida do solvente miscível com água Nanopartículas Quanto maior a proporção do solvente miscívil na mistura menores as partículas formadas.

3-MÉTODO DE NANOPRECIPITAÇÃO FASE AQUOSA Água destilada Tensoativo FASE ORGÂNICA FASE ORGÂNICA Solvente orgânico Solvente orgânico Óleo Polímero Polímero Agente ativo Agente ativo Agitação SUSPENSÃO DE NANOPARTÍCULAS Envolve o uso de um solvente orgânico que é completamente solúvel na fase aquosa externa consequentemente a extração e a evaporação do solvente não são nescesárias para a precipitação do polímero. p.ex. acetona nanoesferas nanocapsulas Fessi et al. Eur Pat. 0275796 B1 (1987).

Metodo – Encapsulação de agente ativo “Nanoprecipitação” – método de deslocação de solvente 1,2% PLURONIC (1) 3% (PLGA / acetona) + 4 mg de agente ativo (2) (2) colocado em (1)

PLGA nanoesferas – Encapsulamento de violaceina PLGA-PLURONIC-PVA system

4-MÉTODO DE SALTING-0UT FASE ORGÂNICA Solvente orgânico Polímero Agente ativo FASE AQUOSA (sal) Água destilada Agitação Tensoativo (PVA) EMULSÃO Água em óleo SUSPENSÃO DE NANOPARTÍCULAS Esta é baseada na formação de uma emulsão pela incorporação, sob agitação, de uma solução aquosa saturada de alcool polivinílico (PVA) em uma solução de polímero dissolvido em acetona. O PVA tem o papel de estabilizar a dispersão. Aqui a miscibilidade das duas fases é impossibilitada pela saturação da fase aquosa com PVA. A precipitação do polímero ocorre quando uma quantidade adicional de água é adicionada permitindo então a difusão da acetona para a fase aquosa. Este método é adequado quando ativo e polímeros são solúveis em solventes polares como acetona ou etanol. Ibrahim et al. Int. J. Pharm. 87, 239 (1992); Allemann et al., Int. J. Pharm. 87, 247 (1992).

5-MÉTODO DE EMULSIFICAÇÃO/DIFUSÃO DE SOLVENTE FASE AQUOSA (saturada em solvente orgânico) Água destilada Tensoativo FASE ORGÂNICA (saturada em água) Agitação Solvente orgânico Polímero Agente ativo EMULSÃO Óleo em água SUSPENSÃO DE NANOPARTÍCULAS Envolve o uso de um solvente parcialmente miscível em água, que é previamente saturado em água para garantir o equilíbrio termodinâmico inicial de ambas as fases. A precipitação Ocorre quando uma quantidade adicional de água é adicionado ao sistema, permitindo então a difusão do solvente para a fase aquosa. Leroux et al. Eur. J. Pharm. Biopharm. 41, 14 (1995). Quintanar-Guerreo et al. Pharm Res. 15, 1056 (1998). Formada a emulsão do tipo óleo/água e o tensoativo é adsorvido na superfície das gotas da fase orgânica dispersas na fase aquosa A adição de água ao sistema desestabiliza o estado de equilíbrio e promove a difusão do solvente na fase aquosa levando à formação das nanopartículas

VANTAGENS Este método apresenta algumas vantagens sobre o método de nanoprecipitação como a possibilidade de controle do tamanho das nanopartículas. Estas apresentam tamanhos superiores àquelas preparadas por nanoprecipitação, normalmente entre 250-600 nm, dependendo de vários parâmetros como tipo e concentração do tensoativo e do polímero, tempo e velocidade de agitação.

-------------------------------------------------------------- Métodos para a preparação de nanopartículas carregadas com fármacos convencionais -------------------------------------------------------------- Método Polímero Fármaco Tamanho(nm) o/w PLA, PLA-b-PEG Lidocaine 247-817 o/w PLA-PEG-PLA Progesterone 193-335 o/w PLGA Dexamethasone 109-155 o/w PEO-b-PBLA Doxorubicin 37 solv-disp PMLAiPr Halofantrin 150-160 solv-disp PMLAnHe Halofantrin 90-190 solv-disp PLGA Vancomycin 160-170 solv-disp PLGA Procaine Hydr. <210 solv-disp PCL, PLA, Nimodipine 81-132 PCL-co-PLA o/w PEO-b-PCL Enalapril maleate 50 o/w PLA Lidocaine 115-123b a PBLG = poly(g-benzyl L-glutamate); PBLA = poly(b-benzyl L-aspartate); PMLAiPr = poly(b-malic acid isopropil ester); PMLAnHe = poly(b-malic acid neohexil ester). b Dimension of unloaded particles.  

Método Polímero Proteina Tamanho (nm) PREPARAÇÃO DE MICRO E NANOPARTICULAS CARREGADAS COM FÁRMACOS PROTEÍCOS.a Método Polímero Proteina Tamanho (nm) w/o/w PLGA L-asparaginase 196-226 w/o/w PLGA BSA ms w/o/w PLGA BSA 100-200 w/o/w PLGA, PLA BSA ms w/o/w PLGA/PLA blend BSA ms w/o/w PLGA, PCL BSA 20-1000 w/o/w PLA Protein C 230-340 w/o/w PLGA FITC-BSA ms FITC-HRP w/o/w PLGA TRH 250-800 w/o/w PLGA IL-1a+BSA ms o/w PLGA Rism. porcine ms o/w Biod. polym. Peptides - PLGA BSA 300-600 w/o/w PLGA rhBMP ms w/o/w PEG-PLGA BSA - w/o/w PEG-co-PBT BSA ms w/o/w PLGA-b-PEO BSA ms a ms = microsize; CP = coprecipitation; FITC-BSA = fluorescein isothiocyanate-labeled BSA; FITC-HRP = fluorescein isothiocyanate-labeled horseradish peroxidase; IL-1a = recombinant human interleukin-1a; rhBMP = recombinant human bone morphogenetic protein-2

Exemplo de encapsulação utilizando nanocápsulas.

Controle das variáveis de processo PREPARAÇÃO Controle das variáveis de processo Precipitação coágulos agregados grandes espuma [tensoativo] temperatura evaporação Não [polímero] solvente Formas arredondadas superfície lisa baixa polidispersidade Sim agitação Modo adição

BSA/PHB159 BSA/PHBV140 BSA/PHB540 BSA/PHB273 1.- PHBV140 libera menos BSA que PHB159 (Diferencias de porosidade nas matrizes) PHBV é menos porosa que PHB. 2.- Pouca diferencia entre PHB540 e o 273. (Conway et al. J. Control. Rel. 49, 1 (1997)

The effect of type of organic phase solvents on the particle size of poly(d,l-lactide-co-glycolide) nanoparticles. Song et al. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 276 (2006) 162–167 Nanoparticulas de PLGA foram preparadas por método de emulsificação/difusão. Efeito de 4 solventes no tamanho da partícula: acetato de etila, carbonato de propileno, acetona e diclorometano. Tres estabilizadores foram usados: Didodecil dimetil brometo de amonio (DMAB), poli(vinil alcool) (PVA) e Pluronic F68. Preparação: 100 mg de PLGA foi dissolvido em 10 ml de vários solventes (EA, PC, ACE,e DCM). As fases orgânicas foram adicionadas em 20 ml de uma fase aquosa contendo o estabilizador. Após uma saturação mutua da fase orgãnica e a aquosa, a mistura foi emulsificada por 1 min com um sonicador de ponta. Para permitir a difusão do solvente orgânico na água, um volume constante de água (80 ml) foi subsequentemente adicionado a emulsão o/w sob uma agitação magnética moderada formando as nanopartículas de PLGA

A distribuição do valor médio de tamanho da partícula forma medidas por espectroscopia de correlação de fótons (NICOMP, model 380, CA, USA). O tamanho da partícula foi expressa como diâmetro médio em volume-peso em nanômetro, e obtido de medidas de três bateladas de nanopartículas. Partículas pequenas foram obtidas usando solventes parcialmente solúveis em água (EA, PC), entretanto partículas grandes foram obtidas usando solvente totalmente solúveis em água (ACE) e solvente imiscíveis em água (DCM). Como as nanopartículas são formadas das gotas de emulsão após difusão do solvente orgânico, seu tamanho é dependente da estabilidade das gotas da emulsão, que colidem e coalescem ou aderem ou aglutinam entre elas. Quando o estabilizador permanece na interfase liquido–liquido durante o processo de difusão, e seu efeito protetor é adequado e logo as nanopartículas são formadas. As partículas pequenas para EA e PC foram atribuídas tanto a a proteção adequada do estabilizador contra a coalescencia e a baixa tensão interfacial entre as fases aquosa e orgânica, resultante de sua natureza de solubilidade parcial em água.

EA DCM ACE AC Quando EA, um solvente orgânico parcialmente solúvel em água foi usado, foram formadas uma pequena e discreta partículas de tamanho de 40–70 nm. Por outro lado, partículas grandes e agregados de 350–450 nm foram observados em DCM como solvente orgânico imiscível em água. Quando ACE, solvente orgânico completamente solúvel em água foi usado, partículas grandes e discretas de 250–400 nm foram obtidas. Das imagens de AFM, pode ser visto que nanopartículas abaixo de 70 nm são obtidas usando um solvente parcialmente solúvel em água (EA) que quando usou-se um solvente imiscível em água (DCM) ou um solvente completamente solúvel em água (ACE). Isto está de acordo com os resultados da distribuição de tamanho de partícula nas Figura 1.

OS AUTORES EXPLICAM ISTO DA SEGUINTE MANEIRA As partículas pequenas para EA e PC foram atribuídas tanto a proteção adequada do estabilizador contra a coalescencia e a baixa tensão interfacial entre as fases aquosa e orgânica, resultante de sua natureza de solubilidade parcial em água. Entretanto, quando DCM foi usado como solvente na fase orgânica praticamente cada formulação resultou em agregação significativa devido a sua natureza imiscível com água e o estabilizador DMAB não foi capaz de prevenir completamente a agregação dos gotas de emulsão, levando a tamanhos de partículas grandes (390 nm). de outra maneira, como ACE é completamente miscível com água, emulsões estáveis entre as fases orgânicas e aquosas não são formadas a pesar da presença de um estabilizador. Logo após de misturar as duas fases, PLGA imediatamente precipita como partículas sub-micron resultando em partículas de tamanho grande.

Contrariamente ao resultado de DMAB na Fig Contrariamente ao resultado de DMAB na Fig. 1, pequenos tamanhos de partículas abaixo de 70 nm não foram, obtidas por PC e EA, e não houve uma grande diferencia na distribuição do tamanho das partículas entre solvente parcialmente solúveis em água (EA e PC) ou solvente totalmente solúvel em água (ACE) e em solvente imiscível em água (MCD) em PVA ou Pluronic F68. Em particular, os tamanhos médios de partículas de nanopartículas de PLGA estabilizadas com PVA mostraram valores similares na Fig. 3, independente na diferencia do solvente na fase orgânica. Também interessante para Pluronic F68 na Fig. 4 que EA mostra tamanho menor que em PC, que mostra diferente perfil com os resultados de DMAB e PVA na Figs. 1 e 3, respectivamente. Em sistemas de estabilizante não iônicos (PVA e Pluronic F68), as partículas estão estabilizadas por impedimento estérico, mas num sistema de estabilizador iônico (DMAB), as partículas são estabilizadas por repulsão eletrostática. Os resultados acima significam que o efeito do tipo de solvente na fase orgânica para obter nanopartículas pequenas de PLGA abaixo de 70 nm chega a ser mais importante quando partículas são estabilizadas por repulsão eletrostática que impedimento estérico.

As partículas menores (50 nm) foram obtidas usando DMAB (estabilizador) e PC (solvente na fase orgânica), entretanto, as partículas maiores (461 nm) foram obtidas usando Pluronic F68 (estabilizador) e DCM (solvente na fase orgânica). Estes resultados indicam que a escolha adequada do solvente na fase orgânica e estabilizador é o fator chave na determinação do diâmetro médio das nanopartículas de PLGA.

SOLVENTE: PC O tamanho das partículas para PVA e Pluronic F68 diminui rapidamente com pequenas mudanças na concentração mas muito pouco para DMAB. Isto indica que com aumento da concentração do estabilizador para PVA e Pluronic F68, mais moléculas do estabilizador são adsorvidas na interfase das gotas de emulsão, permitindo um aumento na proteção contra a coalescencia e resultando em gotas menores da emulsão. Outros autores prepararam nanopartículas de poli(metilmetacrilato) (PMMA) usando PVA como estabilizante por emulsificação/difusão, e pesquisaram o efeito da concentração do PVA no tamanho das nanopartículas de PMMA. Eles observaram que a estabilidade física das nanopartículas de PMMA aumentou com aumento de concentração de PVA, levando a nanopartículas de tamanhos menores. Entretanto, para DMAB, somente uma pequena quantidade de estabilizador é adsorvida na interfase das gotas da emulsão. O excesso permanece na fase aquosa continua e não joga nenhum papel significativo na emulsificação. O tamanho médio das nanopartículas de PLGA preparadas usando DMAB como estabilizante é menor que aqueles com PVA e Pluronic F68, que está de acordo com os resultados dos outros autores.

Quando EA e PC, solventes parcialmente solúveis em água, o tamanho médio diminui rapidamente quando aumenta o volume de água adicionado na faixa de 20–40 ml, mas pouca mudança foi observada acima de 80 ml. Entretanto, para ACE, um solvente totalmente solúvel em água, o volume de água adicionado não joga papel importante no tamanho da partícula comparado EA e PC, e o tamanho da partícula diminui moderadamente quando aumenta o volume de água adicionado. Estes resultados significam que o volume adicionado de água é um fator importante na determinação do tamanho da partícula de PLGA para solventes parcialmente solúveis em água como PC e EA. Também, foi observado que o tamanho médio das partículas de PLGA preparadas usando ACE são maiores que aquelas com EA e PC, que estão de acordo com os resultados da distribuição do tamanho das partículas na Fig. 1.

CONCLUSÕES A solubilidade dos solventes na fase orgânica em água foi um parâmetro importante afetando o tamanho médio de nanopartículas de PLGA, quando DMAB, um estabilizador iônico é usado. nanopartículas abaixo de 70 nm foram obtidas usando solventes parcialmente solúveis em água (EA e PC) que quando usados um solvente totalmente solúvel em água (ACE) ou solventes imiscíveis em água (DCM). Em particular, quando PC foi usado como solvente na fase orgânica, nanopartículas de PLGA abaixo de 50 nm foram obtidas. Entretanto, quando PVA e Pluronic F68, estabilizadores não iônicos foram usados, uma grande diferencia na distribuição do tamanho das partículas entre solvente parcialmente solúvel em água ou totalmente solúveis em água e em solvente imiscível em água não foi observado, e todas as partículas mostraram um grande diâmetro acima de 110 nm, independentemente do tipo de solventes orgânicos.

MODOS DE INTERAÇÃO DE PVA DURANTE PROCESSO DE EMULSIFICAÇÃO

Stolnik et al., Advan. Drug Deliver. Rev. 16, 195 (1995). (enredado) Fig. 1. Diagrama ilustartivo de sistemas de longa circulação. Nanopartículas de poliestireno coberta com Poloxameros e Poloxaminas. (b)nanopartículas de Poliestireno grafted com PEO. (c) nanopartículas de copolímero de Polilactideoglicolideo com polilactideo/glicolideo-PEO, coberto (A) ou preparado de um solvente comum (B) . (d) (‘Self-forming’) Sistema de copolímero em bloco polilactideoglicolideo-PEO. Stolnik et al., Advan. Drug Deliver. Rev. 16, 195 (1995).

NANOPARTICULAS DE MACROMOLÉCULAS Pinto Reis et al. / Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2 (2006) 8– 21 NANOPARTICULAS DE ALGINATO Produzidas por extrusão de gotas de uma solução alginato sódico numa solução de cloreto de cálcio. Os tamanhos das partículas de alginato dependem do tamanho das gotas iniciais. Num avanço adicional as partículas de alginato tem sido produzidas usando um método de gelação modificado de emulsificação/gelação interna como ilustrada na Figura

NANOPARTICULAS DE MACROMOLÉCULAS Pinto Reis et al. / Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2 (2006) 8– 21 NANOPARTICULAS DE QUITOSANO Os métodos propostos para preparar nanopartículas de quitosano estão baseadas na formação espontânea do complexo entre quitosano e polianios (tripolifostato) ou gelação de uma solução de quitosano disperso numa emulsão de óleo. Vários métodos para produzir nanopartículas de quitosano são descrito na literatura. nanopartículas de quitosano produzidos por gelação num método baseado na emulsificação está ilustrado na Figure

NANOPARTICULAS DE MACROMOLÉCULAS Pinto Reis et al. / Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2 (2006) 8– 21 NANOPARTICULAS DE AGAROSE Nanopartículas de agarose foram desenvolvidas para a administração de terapêuticos de proteínas e peptídeos. nanopartículas de agarose foram produzidos pela tecnologia baseada em emulsão como ilustrado na Figura

Preparação de nanocapsulas de PCL e PCL-PEG Determinação de encapsulação Caracterização das nanocapsulas Determinação de toxicidade aguda (LD50) Eficácia antimalaria Determinação de parâmetros cardiovasculares Estatistica Nota: halofantrine é um fármaco mais cardiotóxico dos usados em malaria. Induz uma prolonga intervalo de QT já que é responsável de alterar os canais de potássio produzindo uma repolarização que determina o intervalo QT

Efeito cardiotóxico Percentage variation of QT interval (A). The values represent means±S.E.M. (standard error mean) for 30 min after IV injection of halofantrine solution (Hf. HCl), halofantrine entrapped in nanocapsules (Hf-NC) in doses of 100 mg/kg (n=6) or 150 mg/kg (n=8), unloaded NC (n=8) and DMA/PEG solution (n=8). QT= interval between the beginning of the Q wave and the end of the T wave of ECG

AGRADECIMENTOS