Transcrição e Processamento de RNA Agradecimentos: Profa. Dra. Aline Maria da Silva Instituto de Química- USP Bibliografia: Genes VII - Benjamin Lewin Biologia Molecular Básica-Arnaldo Zaha Lenhinger Principles of Biochemistry (3a. Ed.)

Replicação Transcrição Tradução Proteína Processo para síntese de todos os RNAs da célula Reflete o estado fisiológico da célula O conjunto de genes expressos em uma dada situação é variável Processo catalisado pelas RNAs polimerases Replicação Transcrição Transcrição Reversa Replicação de RNA Tradução Proteína

Principais Tipos de RNA RNA mensageiro (mRNA): contém a informação genética para a sequência de aminoácidos das proteínas RNA transportador (tRNA): identifica e transporta os aminoácidos até o ribossomo RNA ribossômico (rRNA): constituinte dos ribossomos

tRNA -Estrutura secundária com grampos e alças formando um trevo -Alto número de bases modificadas depois da sua transcrição

Bases modificadas nos tRNAs

Processamento do precursor do tRNA tRNA maduro Modificação das bases Processamento

Ribossomo Eucariótico Ribossomo bacteriano 70S (2,7 x 106) Ribossomo Eucariótico 80S (4,6 x 106) rRNAs:

Processamento do precursor do rRNA Metilação das bases Clivagem RNAs maduros RNA precursor 30S

Exemplos de rRNAs: Estrutura secundária com grampos e alças Bases metiladas

E.coli:

Transcrição DNA fita codificadora DNA fita molde RNA transcrito

Síntese de RNA: formação da ligação fosfodiester envolve o ataque nucleofílico do 3’ OH da cadeia crescente no fosfato do carbono 5´do ribonucleosídeo trifosfatado que será incorporado A RNA polimerase não requer um iniciador (primer) para iniciar a síntese do RNA

Bolha de transcrição RNA polimerase Fita molde Direção da transcrição

Direção da transcrição

RNA polimerase de E.coli

RNA polimerase de E.coli Ligação ao promotor RNA polimerase de E.coli As RNA polimerases não tem mecanismo de correção de erro (taxa de erro 10-5) Centro catalítico Reconhecimento específico do promotor

Promotores de genes bacterianos Posição +1 Região -35 Região -10

Reconhecimento e Ligação ao promotor Deslocamento da subunidade sigma Início da Transcrição Deslocamento da subunidade sigma

Footprinting de DNA Regiões ligadas a RNA polimerase Marcação do DNA com 32P Footprinting de DNA Tratamento com DNAse Regiões ligadas a RNA polimerase Separar os fragmentos em uma eletroforese em gel de poliacrilamida. Visualizar fragmentos após exposição a filme de Raio-X

Substituição do fator sigma controla a iniciação: Os distintos fatores sigma reconhecem promotores diferentes

Direção da transcrição Bolha de transcrição RNA polimerase Fita molde Direção da transcrição 5´ 3´

Terminação da transcrição através da formação do grampo de terminação

Terminação da transcrição dependente da proteína Rho Rho (46kDa, ativa como hexâmero) move-se ao longo do RNA acompanhando a RNA polimerase Com a pausa da RNA polimerase na sequência de terminação, Rho alcança a enzima Rho desenrola o híbrido RNA-DNA Sequência de Terminação dependente de Rho: rica em C

A RNA polimerase bacteriana é inibida por rifamicina (liga a subunidade beta) A subunidade beta da RNA pol contem 5 sítios de ligação para rifamicina O antibiótico previne o início da síntese da cadeia de RNA, imediatamente após a formação da primeira ligação fosfodiester

Agentes intercalantes inibem tanto a transcrição com a replicação, em procariotos e eucariotos Actnomicina D Acridina

0 gene geralmente é maior do que a sequência codificadora para a proteína 5´UTR 3´UTR Proteína UTR: Região não traduzida (Untranslated region)

0 mRNA bacteriano pode ser policistrônico (poligênico) Distância intergênica (-1 a 40 bases) Gene A Gene B 3´UTR 5´UTR fim início

Etapas envolvidas na expressão de genes em eucariotos Núcleo Etapas envolvidas na expressão de genes em eucariotos Transcrição Processamento Transporte Tradução Citoplasma

RNA polimerases de eucariotos Nucleólo rRNA Várias subunidades RNA pol II Nucleoplasma hnRNA (transcrito primário) snRNA RNA pol III rRNA 5S tRNAs RNA pol Mitocondrial Mitocondria 01 subunidade RNA pol de Cloroplastos Cloroplasto Similar as bacterianas Requerem proteínas auxiliares: fatores de transcrição

A RNA polimerase II é inibida especificamente por -amanitina Isolado do cogumelo Amanita phalloides Altamente tóxico Bloqueia a etapa de elongação

Estrutura típica de um gene transcrito pela RNApol II Enhancer Promotor Gene

Estrutura de Promotores da RNA Pol II

Promotores de genes transcritos pela RNApol II Tata Binding Protein Complexo TFIID

Promotores de genes transcritos pela RNApol III e I: A TBP também é componente dos complexos de iniciação de transcrição destes promotores

Domínios dos Fatores de Transcrição Domínio de Ativação Domínio conector Domínio de ligação ao DNA

Proteínas necessárias para transcrição a partir de promotores reconhecidos pela RNA Pol II

Eucariotos Procariotos Splicing

(modificação da extremidade 5´do hnRNA) Adição do 5´CAP

Etapas para geração do transcrito maduro Transcrição e adição do 5´cap (hnRNA) Clivagem, poliadenilação e splicing

Sequencia sinal para poliadenilação Adição da cauda poli (A) na extremidade 3´do hnRNA (transcrito primário): ~200 Adeninas Sequencia sinal para poliadenilação

Genes eucarióticos são em geral interrompidos por introns (hnRNA) Splicing: remoção dos introns Genes eucarióticos são em geral interrompidos por introns

Mamíferos tem maior número de exons/gene número de

Tamanho de introns em vertebrados é variado Exons que codificam para proteínas são usualmente pequenos

AGGUAAGU-----Pyr---A--NCAGG Remoção de introns pelo “spliceossomo”: associação de ribonucleoproteínas pequenas (snRNPs) formando um complexo de 3x103 kDa

Auto-splicing:introns do grupo I

Auto-splicing: introns do grupo I

Auto-splicing: introns do grupo II