Expressão Recombinante em Células Eucarióticas 1-Introdução 2-Sistemas de expressão em leveduras Edmar Vaz de Andrade
1-introduçao Dificuldades em sistemas de expressão em Escherichia coli 1-Processamento pós-traducional da proteína (glicosilação) 2-Enovelamento da proteína na conformação nativa (corpos de inclusão) 3-Degradação da proteína recombinante pela E. coli.
Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisae 2-Sistemas de expressão leveduras Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisae Fácil manipulação Cultivo relativamente rápido preservam as características favoráveis das bactérias Maior proximidade filogenética de animais do que as bactérias processamento pós-traducional comparável ao dos eucariotos pluricelulares
Padrão de Glicosilação 2-Sistemas de expressão leveduras Padrão de Glicosilação
2-Sistemas de expressão leveduras Pichia pastoris Alto rendimento de proteína recombinante Glicosilação comparável à realizada em células animais Maior eficiência de secreção
2-Sistemas de expressão leveduras Vetor de Expressão em Pichia pastoris Origem de replicação em E. coli Gene AmpR Promotor álcool-oxidase Terminador de transcrição Peptídeo sinal Gene selvagem para biossíntese de histidina INVITROGEN
2-Sistemas de expressão leveduras Transformação de leveduras P. pastoris HIS4- Recombinação Homóloga INVITROGEN
2-Sistemas de expressão leveduras Vetor de Expressão em Pichia pastoris Marca auxotrófica (nutricional) para biossíntese de histidina Cultivo em meio de cultura sem histidina Clones não transformados são inviáveis
2-Sistemas de expressão leveduras Vetor de Expressão em Pichia pastoris Indução da síntese de proteína recombinante com adição de metanol como fonte de carbono Para inibir o promotor: cultivo na presença de glicerol como fonte de carbono Obtenção da proteína solúvel no sobrenadante