Instituto Adolfo Lutz - SES/SP BOTULISMO - Diagnóstico Laboratorial. Procedimentos de Coleta e Técnicas para Detecção da Toxina em Pacientes e Alimentos - Miyoko Jakabi Instituto Adolfo Lutz - SES/SP

INTRODUÇÃO BOTULISMO: doença que se manifesta pela ação de uma potente toxina produzida pelo Clostridium botulinum Descrito pela primeira vez em 1879, por Ermengen, na Bélgica Botulismo - “botulus”: salsicha

BOTULISMO Botulismo alimentar: ingestão de alimentos contaminados com a toxina pré-formada Botulismo Ferimento: causado pela multiplicação do microrganismo com produção de toxina em feridas contaminadas Botulismo infantil:produção endógena de toxina pela germinação de esporos do C. botulinum no intestino (< 1 ano)

C. botulinum - características Bacilos retos ou ligeiramente curvos, Gram-positivos, imóveis, anaeróbios, 0,5-2,0 m de largura e 1,6-22,0 m de comprimento, esporos ovais e subterminais

C. botulinum 7 tipos de C. botulinum: A, B, C, D, E, F e G diferentes antigenicamente A, B, E e raramente F: humanos C e D: pássaros e bovinos G (1970): não confirmado como causador de doença - (Argentina)

Esporos

Esporos

C. botulinum Toxina botulínica: proteína de 150 kda cadeia pesada de 100 kda e cadeia leve de 50 kda ligadas por pontes de sulfeto Toxina C2: 1 cadeia de 55 kda e 1 cadeia de 105 kda não são ligados covalentemente

Síntese da toxina Presente em pequena quantidade na fase logarítmica liberada durante a autólise bacteriófagos: tipos C e D plasmídeos

Ação da toxina botulínica Neurotoxina resistente ao ácido estomacal absorvida intacta pelo trato gastrointestinal e entra na corrente sangüínea se liga as células nervosas via gangliosídeos

Cont. 1- ligação da cadeia leve aos receptores na membrana 2- Internalização da toxina ativa 3- translocação da toxina p/ o interior da célula (pinocitose) 4- fase lítica - bloqueio da liberação da acetilcolina

Ação da toxina O neurotransmissor envia impulsos elétricos p/contrair o músculo terminações nervosas secretam a acetilcolina responsável pela contração muscular pacientes com botulismo: neurotoxina liga-se aos terminais nervosos inibindo a liberação da acetilcolina, o músculo não contrai, ocorrendo a paralisia

C. botulinum no ambiente Largamente distribuído no ambiente trato intestinal de animais, pássaros e peixes cadáveres de animais silvestres e pássaros contém > quantidade tipos A, B e F: terrestres tipo E: ambientes aquáticos tipo A: oeste dos EUA; tipo B leste dos EUA e Europa; tipo G: restrito a Argentina

Alimentos associados com botulismo Alimentos enlatados ou envasados em vidros industrializados: subprocessamento ou contaminação pós-processo conservas caseiras: subprocessamento e acidez

Alimento Infantil Mel: fonte significativa de C. botulinum Cereal de arroz e xarope de milho: números baixos de esporos

Botulismo

Diagnóstico laboratorial Presença da toxina circulante, lavado gástrico ou conteúdo intestinal na fase inicial da doença Análise do alimento epidemiologicamente implicado

Método: Bioensaio Soro centrifugação refrigerada Inoculação em 2 camundongos de 20-25g (0,5ml por animal) -IP

BIOENSAIO

Extração da toxina de alimentos, lavado gástrico e fezes solução de gel fosfato (1:1 p/v, homogeneização, manutenção por uma noite, geladeira) Centrífuga refrigerada (4ºC/ 2.500 a 3.000 rpm/20 min.)

Tratamento do sobrenadante Separado em 2 porções: tratada térmicamente: água ebulição/10 min. tripsinizada: acertar o pH p/ 6,2; para cada 1,8 ml do sobrenadante, acrescente 0,2 ml de sol. Tripsina; incubar a 37ºC/1h OBS: toxina botulínica é termolábil se na amostra está presente só a pré toxina, é necessária a tripsinização para liberar a parte tóxica

Triagem da presença de toxina por bioensaio Selecionar no mínimo 8 camundongos (20-25g) 2 animais: inoculados com porção fervida já resfriada 2 animais: inoculados com porção tripsinizada 2 animais: inoculados c/ a porção extraída, não tratada termicamente e não tripsinizada 2 animais são controle do ensaio

Sintomatologia - camundongos OBS constantemente por 6 h após este período, os animais são observados a cada 6 h, até um período máximo de 72h sintomas: respiração difícil, e elaborada, acinturamento tipo “cintura de vespa”, por paralisia do diafragma em contração morte

Confirmação da toxina botulínica Os animais inoculados com a porção fervida não morrerem os animais inoculados com a porção tripsinizada morrerem animais controle não morrerem OBS: Os animais inoculados com a porção não tratada podem ou não morrer. Caso morram, significa que a toxina ativa estava presente. Caso não morram, significa que a pré toxina estava presente.

Identificação da toxina Misturar amostra positiva com anti-soros monovalentes (A,B,E e F) e polivalentes Inocular em camundongos os animais inoculados, deverão apresentar os sintomas de botulismo, exceto aqueles que foram inoculados com a antitoxina que foi capaz de inativação

Interpretação Os animais que não apresentarem sintomas permitem a identificação do tipo presente

Interpretação Se os camundongos não forem protegidos por 1 dos monovalentes: 1- pode ter muita toxina no alimento 2- pode ter mais de 2 tipos de toxinas 3- mortes podem ser devidas a outras causas Se ambos os sobrenadantes, aquecido e não aquecido, forem letais, as mortes provavelmente não são devidas a toxina botulínica

Aplicação da toxina botulínica Tratamento de espasmos musculares de vários tipos: estrabismos, dores musculares de faces e pescoço limitação da terapia: injeção deve ser repetida

Botox

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