Ca2+-ATPase e Produção de Calor Daniel M B Lima

Introdução Retículo Sarcoplasmático (RS): Principal reservatório intracelular de Ca2+ em músculo esquelético; SERCA: bombeia Ca2+ para o interior do RS, as custas de ATP.

Introdução Duas regiões distintas, morfologicamente e funcionalmente: Túbulos longitudinais Fração leve (LSR); Enriquecida em Ca2+-ATPase; Cisternas terminais Fração Pesada (HSR); Contato Direto com os Túbulos T.

Introdução

Introdução SERCAs: Conversão de energia química liberada na quebra do ATP em energia osmótica (transporte de Ca2+) e produção de calor (termogênese); SERCA 1 Produz mais calor durante a hidrólise do ATP do que qualquer outra SERCA; Encontrada, predominantemente, em musculatura esquelética branca e tecido adiposo marrom.

Introdução SERCA 1: Ciclo catalítico, 2 vias: Acoplada: Transporte de Ca2+ + Liberação de Calor Desacoplada: Liberação de Calor A via desacoplada é muito importante na produção de calor, tanto em grandes mamíferos quanto humanos adultos; Em hipotireoidismo e exposição ao frio, duas condições que afetam a termogênese, a expressão de SERCA 1 está aumentada.

Introdução Evidências têm mostrado que o K+ afeta passos intermediários do ciclo catalítico da SERCA 1; O presente artigo explora os efeitos do K+ na atividade termogênica da SERCA 1.

Metodologia Captação de Ca2+ Foram utilizadas vesículas leves e pesadas de retículo sarcoplasmático isoladas de músculo branco de membro posterior de coelhos. Antes do uso as vesículas foram diluídas em tampão adequado, para dar 4µM de Ca2+ livre Captação de Ca2+ Traços de 45Ca foram incluídos no meio O meio foi filtrado e a radiação remanescente nos filtros foi avaliada por cintilação liquida. Para os experimentos de efluxo, as vesículas foram pré-carregadas com cálcio, e com o equilíbrio alcançado, KCl foi adicionado ao meio.

Metodologia Atividade ATPásica Calor da Reação Medição da liberação de 32Pi de [γ-32P]ATP. A reação foi interrompida com TCA e o [γ-32P]ATP não hidrolisado foi retirado com carvão ativado Duas diferentes ATPases Dependente de Mg2+, medida na presença de EGTA Dependente de Ca2+, descontando a atividade da anterior Calor da Reação Calorímetro A Entalpia calorimétrica (ΔHcal ) foi calculada dividindo-se a quantidade de calor liberado pela quantidade de ATP hidrolisado Valores negativos: reação exotérmica Valores positivos: reação endotérmica

Metodologia Procedimento Experimental Todos os experimentos foram realizados a 35ºC Durante um experimento típico, o meio utilizado nos ensaios é dividido em 3 amostras que são utilizadas simultaneamente para avaliação da captação de Ca2+, hidrólise de ATP e liberação de calor Inibidor de ATP sintase foi utilizado a fim de se evitar possível interferência devido a contaminação.

Resultados Efeito do KCl na captação de Ca2+ pela SERCA 1

Resultados

Resultados O efeito observado está relacionado ao cátion (K+) ou ao ânion (Cl-)?

Resultados Efeito do KCl no efluxo de Ca2+

Resultados KCl provoca diminuição da concentração de equilíbrio de Ca2+ Inibição da atividade de Ca2+-ATPase? Não

Resultados Correlação entre as taxas de hidrólise de ATP e produção de calor Estudos anteriores demonstraram que: (i) Em leaky LSRs, que não conseguem acumular Ca2+ durante a hidrólise de ATP, a quantidade de calor liberado por mol de ATP clivado é 50% menor que em vesículas intactas que acumulam Ca2+. (ii) Ao contrário, a ΔHcal da hidrólise de ATP não é modificada pelo acúmulo de Ca2+ em HSRs Esses ensaios, realizados em meio contendo KCl, foram confirmados.

Resultados Utilizando meio sem KCl O calor liberado por molécula de ATP clivada é maior.

Resultados Efeitos da Valinomicina na captação de Ca2+ e na produção de calor

Resultados

Discussão Receptores de rianodina interagem com receptores de diidropiridina e essa interação física parece ser necessária para o acoplamento excitação-contração que ocorre em células musculares de mamíferos; Enquanto o potencial de ação se propaga pelo Túbulo T também ocorre uma mudança nas concentrações de Na+ e K+ nas junções comunicantes entre esses túbulos e o RS; Variações nas concentrações destes íons nessa região podem ser importantes para aumentar o efluxo de Ca2+ na cisterna terminal; Alguns estudos já demonstraram que Na+ e K+ interagem com o receptor de rianodina, aumentando sua permeabilidade ao Ca2+.

Discussão Devido a localização desse receptor predominantemente em HSR, o efeito do K+ na liberação de Ca2+ poderia ser atribuido à ligação do K+ no receptor de rianodina; Entretanto, isso não explica a diferença na atividade termogênica encontrada entre vesículas LSR e HSR; Alguns estudos já sugeriram que o K+ se liga a Ca2+ ATPase e altera passos do seu ciclo. De fato, o presente trabalho mostrou alterações na atividade ATPásica, tanto em HSR quanto LSR Outras proteínas associadas, no HSR. O aumento de K poderia interferir nestas proteínas, que por sua vez atuariam concomitantemente na Receptor de Rianodina e na SERCA