Imunologia de Transplantes Bruno Salomé de Morais Mestrando em Ciências Aplicadas à Cirurgia e Oftalmologia Orientador: Prof. Evaldo Nascimento

Introdução Imunologia de Transplantes: compatibilidade imunogenética entre doadores e receptores ao transplante de órgãos e tecidos Compreensão da cura de muitas doenças pela implantação de células,tecidos ou órgãos saudáveis de um indivíduo para outro. A imunologia de transplantes constitui-se um importante capitulo da imunologia, onde se estuda a compatibilidade imunogenética entre doadores e receptores ao transplante de orgaos e tecidos Transplantação, do modo que o termo é usado em imunologia, refere-se ao acto de transferir células, tecidos ou órgãos de um local para outro. O desejo de realizar transplantes nasceu da compreensão de que era possível curar muitas doenças pela implantação de células, tecidos ou órgãos saudáveis de um indivíduo para outro.

Introdução Desafios à transplantação Desenvolvimento de técnicas cirúrgicas Equipe Multidisciplinar bem Treinada Desenvolvimento de imunossupressores Avaliação imunológica Rejeição de tecidos transplantados Aumento da sobrevida do enxerto O desenvolvimento de técnicas cirúrgicas que permitem uma fácil re-implantação de tecidos constituiu um importante avanço para o sucesso dos transplantes. No entanto, levantada esta barreira, restam muitas outras a ultrapassar para que a transplantação de órgãos se torne um tratamento médico rotineiro. Uma das principais lacunas é, sem dúvida, a extrema escassez de órgãos. Além desta barreira, a ação do sistema imunitário na rejeição de tecidos transplantados continua a ser um sério impedimento ao sucesso desta intervenção médica. Padronizaçao de protocolos Acompanhamento clinico pre peri e pos operatorio

O complexo de histocompatibilidade (MCH) denominado no homem de Sistema HLA (Human Leukocyte Antigen) está envolvido nos mecanismos de reconhecimento celular, visando proteger o organismo de agressões externas e das regulação da resposta imunológica

A rejeição é o reflexo da resposta imunológica aumentada (inicialmente local) envolvendo, na maioria das vezes, os antígenos HLA do órgão transplantado Reflete reatividade imunologica aumentada (inicialmente local ) contra os antigenos hla e nao hla presentes no orgao transplantado

Resposta Imunológica Intervenção dos elementos clássicos de defesa, como o envolvimento de anticorpos, numerosos mecanismos de regulação da resposta celular e citocinas, que modulam a intensidade da resposta A resposta imunológica se estabelece pela intervenção dos elementos clássicos de defesa, como o envolvimento de anticorpos, células, de numerosos mecanismos de regulação da resposta celular e de fatores amplificadores celulares (citocinas). Tudo isso contribui para modular a intensidade da resposta, que é o reflexo de uma sofisticada cooperação entre diferentes células imunocompetentes

Tipos de Transplante Autoenxerto Transplante de órgãos ou tecidos procedentes do próprio indivíduo Não se desenvolve resposta imune Exemplos: Ponte de Safena/Mamária Enxerto de pele Transplante de MO A semelhança genética entre doador e receptor contribuirá para o sucesso e a sobrevida do órgão transplantado. Assim os transplantes de órgãos e tecidos são classificados em:

Tipos de Transplante Isoenxerto Transplante de órgãos ou tecidos entre indivíduos geneticamente idênticos Não há desenvolvimento de resposta Isografts: em indivíduos geneticamente idênticos, como clones ou gémeos monozigóticos, é possível transplantar tecido sem que ocorra rejeição.

Tipos de Transplante Aloenxerto Transplantes entre indivíduos da mesma espécie, geneticamente diferentes Enxerto é rejeitado Grande maioria dos enxertos Alografts: tecidos ou órgãos transplantados entre membros da mesma espécie, geneticamente diferentes. Nos seres humanos todos os transplantes de um individuo para outro são deste tipo, com excepção dos gêmeos monozigóticos. Sendo este tecido geneticamente diferente do receptor, este tipo de transplante é normalmente reconhecido como non-self pelo sistema imunitário resultando na sua rejeição.

Tipos de Transplante Xenoenxerto Transplantes entre indivíduos de espécies diferentes Enxerto fortemente rejeitado neste tipo de transplantes os tecidos são transferidos entre espécies diferentes. Obviamente estes casos exibem uma elevada disparidade genética provocando uma vigorosa rejeição. Este tipo de transplante tem sido feito experimentalmente com órgãos de macacos tranplantados ao homem ou de macacos para porcos. O porco tem sido estudado como doador de orgaos por apresentar crescimento rapido e por ter orgaos de tamanho semelhante aos dos humanos. Porcos transgenicos ou geneticamente semelhantes aos pacientes tem sido criados em alguns laboratorios dos EUA ou Europa tendo em conta a falta significativa de órgãos doados este tipo de transplante poderá ser uma alternativa no futuro.

Complexo Maior de Histocompatibilidade (MHC) Região gênica hipervariada, localizada no braço direito cromossoma 6 humano Classes I, II e III O MHC é uma região gênica, hipervariada, localizada no braço direito do cromossoma 6 humano. Ele codifica glicoproteinas denominadas antígenos leucocitarios humanos (HLA) que na maioria das vezes estão envolvidos na rejeição de transplantes Nessa região são codificadas três classes de moléculas: as classes I, II e III. As moléculas da classe III parecem não ter importância na transplantação. Os principais genes responsáveis pelo reconhecimento de antigénios externos, o complexo de histocompatibilidade maior (MHC), estão localizados no braço curto do cromossoma 6. Nos seres humanos, estes genes codificam várias proteínas da superfície da membrana celular. Estes aloantigénios são conhecidos como antigénios de leucócitos humanos (HLA – Human leukocyte antigens) e o seu elevado polimorfismo permite ao sistema imunitário reconhecer antigénios self e non-self. Os genes MHC podem ser divididos em duas classes: Os MHC de classe I (HLA-A, HLA-B e HLA-C) encontram-se em praticamente todas as superfícies celulares. Esta classe de MHC reconhece antigénios proteicos externos, incluindo tecidos transplantados e são reconhecidos por linfócitos T com especificidade antigénica. Geralmente, as moléculas de classe I são reconhecidas por linfócitos T citotóxicos ou CD8+. Por outro lado, os MHC de classe II (HLA-DR, HLA-DP e HLA-DQ) apenas se encontram em células que apresentam antigénios (APC – antigen-presenting cells) como os linfócitos B, macrófagos e células dendríticas. Pensa-se que os MHC de classe II são os que desempenham o papel predominante na resposta imunitária inicial a antigénios de tecidos transplantados. Ao entrarem em contacto com um antigénio non-self, os HLA de classe II activam os linfócitos TH (helper ou CD4+) que, por sua vez, sofrem uma expansão clonal através da produção de citoquinas reguladoras (figura 1). Codifica glicoproteínas HLA que na maioria das vezes estão envolvidos na rejeição de transplantes

MHC e HLA Glicoproteína de classe I Codificadas nos locus HLA A, B e C. Estruturas químicas semelhantes Diferem nas seqüências de aminoácidos da molécula, o que lhes confere especificidade Encontram-se em praticamente todas as superfícies celulares Reconhece antígenos protéicos externos, incluindo tecidos transplantados São reconhecidos por linfócitos T citotóxicos (CD8+) com especificidade antigênica. Glicoproteina de classe I: são codificadas nos locus HLA A,B e C. Elas apresentam estruturas químicas semelhantes mas diferem nas sequencias de aminoacidos da molecula, o que lhes confere especificidade. Cada individuo tem dois diferentes HLAs para cada locus HLA A,B e C. Os MHC de classe I (HLA-A, HLA-B e HLA-C) encontram-se em praticamente todas as superfícies celulares. Esta classe de MHC reconhece antigénios proteicos externos, incluindo tecidos transplantados e são reconhecidos por linfócitos T com especificidade antigénica. Geralmente, as moléculas de classe I são reconhecidas por linfócitos T citotóxicos ou CD8+.

MHC e HLA Glicoproteína de classe II Codificadas nos locus HLA DR,DP,DQ. Diferem entre indivíduos e estão mais envolvidos na resposta imunológica. Apenas se encontram em células que apresentam antígenos como LB, macrófagos e células dendríticas. Papel predominante na resposta imunitária inicial a antigénios de tecidos transplantados Ao entrarem em contacto com um antígeno non-self, ativam linfócitos T helper (CD4+) que, por sua vez, sofrem expansão clonal através da produção de citocinas reguladoras As glicoproteinas de classe II diferem entre indivíduos e estão mais envolvidos na resposta imunológica. os MHC de classe II (HLA-DR, HLA-DP e HLA-DQ) apenas se encontram em células que apresentam antigénios (APC – antigen-presenting cells) como os linfócitos B, macrófagos e células dendríticas. Pensa-se que os MHC de classe II são os que desempenham o papel predominante na resposta imunitária inicial a antigénios de tecidos transplantados. Ao entrarem em contacto com um antigénio non-self, os HLA de classe II activam os linfócitos TH (helper ou CD4+) que, por sua vez, sofrem uma expansão clonal através da produção de citoquinas reguladoras

Tipagem HLA Antígenos HLA estão presentes nas membranas de todas as células do organismo e como antígenos solúveis nos líquidos do corpo. São mais bem expressos nos linfócitos Tifipicações HLA Biologia Molecular (DNA genômico-PCR) Os antigenos HLA estao presentes nas membranas de todas as celulas do organismo e como antigenos soluveis nos liquidos d corpo. Esses antigenos são mais bem expressos nos linfocitos. Devido a grande facilidade em obter tais cels elas são usadas na tipificaçao hla As tifipicacoes hla são feitas rotineiramente nos laboratorios de imunologia de transplantes, pela tecnica de citotoxicidade, empregando –se um painel de anti soros para cada antigeno hla. Os anticorpos utilizados são de origem humana como os soros de multiparas e anticorpos monoclonais

Prova Cruzada Patel e Terasaki – 1968 Técnica de citotoxicidade - identificação pacientes com anticorpos anti-HLA soro do receptor é colocado em pequenos orifícios contendo óleo na microplaca Terasaki 2000 linfócitos do doador em meio para célula são adicionados nestes orifícios contendo os soros Adição aos orifícios complemento e eosina Análise por microscopia invertida A prova cruzada foi padronizada em 1968 por patel e terasaki. A técnica de citotoxicidade consiste em identificar pacientes com anticorpos circulantes anti HLA O soro do receptor é colocado em pequenos orifícios contendo óleo na microplaca Terasaki. Em seguida 2000 linfócitos do doador em meio para célula são adicionados nestes orifícios contendo os soros. Após algum tempo adiciona-se aos orifícios o complemento e, em seguida, o corante eosina, o qual será o indicador da reação que será analisada por leitura através de microscópio invertido A prova cruzada contra LT é contra indicação absoluta para o transplante. A presença de anticorpos pode indicar prova cruzada positiva para LB e negativa para LT. No caso de receptores hipersensibilizados, é necessario realizar a prova cruzada contra LT atraves da citometria de fluxo. Se persistir negativa, o transplante poderá ser realizado. Se positiva, o tx esta contraindicado As provas cruzadas tem sido modificadas ao longo do tempo para aumentar a sensibilidade do teste em relacao ao teste padrao, permitindo melhor avaliacao dos pacientes no pre transplante. . Apesar do aumento dos falso positivos, estes testes tem evitado as rejeicoes agudas e hiperagudas. Essas rejeicoes, quando acontecem, estao relacionadas com anticorpos pre formados e com antigenos não pertencentes ao sistema HLA.

Prova Cruzada Prova cruzada contra LT é contra indicação absoluta para o transplante. A presença de anticorpos pode indicar prova cruzada positiva para LB e negativa para LT. No caso de receptores hipersensibilizados, é necessário realizar a prova cruzada contra LT através da citometria de fluxo. Se persistir negativa, o transplante poderá ser realizado. Se positiva, o tx esta contra indicado Maior sensibilidade aumento de falso positivos, diminuição de rejeições agudas e hiperagudas.

Melhor Mecanismo para evitar Rejeições Tipagem de Tecidos – Compatibilidade de HLA Metodologia da Tipagem – Reação em Cadeia da Polimerase para detectar resíduos altamente polimórficos em HLA-A, HLA-B, HLA-DR, HLA-DP e HLA-DQ no doador e no receptor

Mecanismos efetores da rejeição de aloenxertos Podem ocorrer três tipos principais de rejeição Hiperaguda Aguda Crônica Sinais de perigo: Febre,hipertensão,edema, aumento súbito de peso,mudança de ritmo cardíaco e dor no local do transplante.

Rejeição Hiperaguda Minutos, horas ou poucos dias após a intervenção cirúrgica Reação de Anticorpos pré formados Sedimentação de eritrócitos/microtrombos nos glomérulos

Função do órgão afetada: Deposição de anticorpos Ativação do complemento Destruição vascular Transplantes renais são mais susceptíveis Prevenção : Detecção do Ac (Cross-Matching)

Reação Aguda É a mais comum Primeiros seis meses após a transplantação Mediada por linfócitos T Infiltração do Tx e destruição das células que o compõe Drogas imunossupressoras: eficazes em conter essa rejeição - inibição da proliferação celular

Rejeição Crônica Função lentamente perdida Fibrose/Hipertrofia Coração Doença da a. coronária Rins  Fibrose intersticial Fígado  Destruição do Epitélio biliar Etiologia não muito clara Não há tratamento padrão

Painel de reatividade Painel de reatividade contra painel de linfócitos (PRA): usado para avaliar o estado imunológico de pacientes, através da detecção de anticorpos anti-HLA nos pacientes que estão na lista de espera do transplante. permite avaliar imunologicamente estes pacientes, facilitando a administração de imunossupressores. O painel de reatividade contra painel de linfócitos (PRA) é usado para avaliar o estado imunológico de pacientes, através da detecção de anticorpos anti HLA nos pacientes que estão na lista de espera do transplante. Ela tem sido de grande utilidade para as equipes transplantadoras pois permite saber como estão imunologicamente estes pacientes, facilitando assim a administração de imunossupressores.

Painel de reatividade reatividade normal (<10%) reatividade baixa (<20%) reatividade média (<50%) reatividade alta (<80%) reatividade muito alta (>80%) Causas de sensibilização : transplante, gestações e transfusões sanguíneas O PRA aumenta com o número de transfusões. O PRA que deve ser repetido em 15 dias após a transfusão de papa hemácias A preservação do sangue em geladeira por período superior a 7 dias torna o sangue menos imunogênico O PRA dos pacientes podem ser teoricamente classificados em: a) reatividade normal (<10%), b) reatividade baixa (<20%), c) reatividade média (<50%), d) reatividade alta (<80%), reatividade muito alta (>80%) Entre as causas de sensibilização podemos citar: transplante, gestações e transfusões sanguíneas Em geral o PRA aumenta com o numero de transfusões que o paciente recebe quando esta esperando o transplante. Uma transfusão sanguínea pode mudar o seu PRA que deve ser repetido em 15 dias após a transfusão de papa hemácias A preservação do sangue em geladeira por período superior a 7 dias torna o sangue menos imunogênico

Solicitação de Exames para Transplantes Compatibilidade ABO Avaliação imunogenética pré transplante (tipificação HLA e provas cruzadas) Os pacientes em preparo para o transplante são previamente selicionados pela compatibilidade ABO Em seguida são realizados os exames para avaliação imunogenética pre transplante (tipificação HLA e provas cruzadas) de acordo com o tipo de transplete a ser realizado como mostra o quadro abaixo