1. Energia radiante = Radiação eletromagnética Fluorescência 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética Natureza da radiação eletromagnética Espectro eletromagnético. Natureza dual: onda/partícula 2. Fluorescência. Interação radiação eletromagnética-matéria. Luminescência: fluorescência e fosforescência. Fluorescência: Diagrama de Jablonski. Fluoróforos. Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola

Energia Radiante – Radiação eletromagnética. Velocidade da onda Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola

Espectro da radiação eletromagnética Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola

Espectro da radiação eletromagnética Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola

Natureza dualística - onda Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola

Natureza dualística - partícula Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola

Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola

Interação radiação EM-matéria: reflexão Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola

Interação radiação EM-matéria: refração Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola

Interação radiação EM-matéria: difração Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola

Microscopia Confocal: Teoria e técnica 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética Natureza da radiação eletromagnética Espectro eletromagnético. Natureza dual: onda/partícula 2. Fluorescência. Interação radiação eletromagnética-matéria. Luminescência: fluorescência e fosforescência. Fluorescência: Diagrama de Jablonski. Fluoróforos. 3. Microscopia de transmissão 4. Microscopia de fluorescência “wide-field” 5. Microscopia confocal 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão. Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola

Luminescência – Fluorescência e fosforescência Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola

Luminescência – Fluorescência e fosforescência Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola

Fluoróforos de interesse em Biologia Fluoresceína Quinina Rodamina Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola

Laser x HBO Espectro do He-Ne laser Espectro da HBO (mercury-vapor high pressure arc lamp) Laser (Light Amplification by Stimulated Emission Radiation) Laser é um instrumento óptico-eletrônico que emite radiação coerente, em um feixe estreito, de baixa divergência, em um comprimento de onda definido (monocromático) Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola

Laser x HBO Espectro do He-Ne laser Espectro da HBO (mercury-vapor high pressure arc lamp) Laser (Light Amplification by Stimulated Emission Radiation) Laser é um instrumento óptico-eletrônico que emite radiação coerente, em um feixe estreito, de baixa divergência, em um comprimento de onda definido (monocromático) Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola

Microscopia Confocal: Teoria e técnica 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética Natureza da radiação eletromagnética Espectro eletromagnético. Natureza dual: onda/partícula 2. Fluorescência. Interação radiação eletromagnética-matéria. Luminescência: fluorescência e fosforescência. Fluorescência: Diagrama de Jablonski. Fluoróforos. 3. Microscopia de transmissão 4. Microscopia de fluorescência “wide-field” 5. Microscopia confocal 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão. Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola

BCECF – pH indicator

BCECF images Fluorescence images Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola

Questões 1 Examine um eletródio de vidro para pH. Identifique o eletródio sensível e o de referência. Discuta este eletródio de referência (não-polarizabilidade). Depois meça as diferenças de potencial elétrico que o eletródio desenvolve em duas soluções, de pH 4.05 e 6.86. Construa a curva de calibração par o sistema. Meça a voltagem em uma solução de pH a determinar. Determine a concentração de H+ nesta solução. 2. Considere duas soluções de KCl, de 100 mM e 10 mM. Suponha estas soluções em compartimentos separados por uma membrana seletiva, permeável apenas ao cátion. Qual será a diferença de potencial elétrico entre os dois compartimentos (Temperatura de 25⁰C). Aventure-se em considerações da interferência da capacitância de membrana sobre o desenvolvimento da diferença de potencial elétrico. 3. Suponha uma molécula que absorvesse fótons de uma dada energia (ħν) e emitisse radiação, relaxando ao estado basal, após alguns picosegundos (10-12s). Esta molécula poderia ser utilizada como fluorescente? 4. Discuta a estimativas de razão de fluorescência. Porque os indicadores que permitem medidas de razão são mais convenientes nas medidas intracelulares. Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola