Avaliação da viabilidade celular pela técnica do MTT UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL-LABIOEX Avaliação da viabilidade celular pela técnica do MTT Ms. Karina Bettega Felipe Florianópolis, maio de 2011

1. Princípio

2. Amostra Células aderentes cuja viabilidade celular deseja-se avaliar após o seu tratamento com o composto/extrato em estudo. 3. Reagentes/soluções/suspensão celular Meio de cultura completo: meio DMEM alto teor de glicose suplementado com soro fetal bovino (10%) e solução de antibióticos penicilina 10.000u/mL e estreptomicina 10.000µg/mL (1%); Solução de MTT (0,5mg/mL)- Preparar 10 mL Pesar 5mg de MTT/ Adicionar 1mL de PBS/ Adicionar 9mL de meio de cultura completo

Suspensão celular na concentração de 0,5X105 células/mL 4. Procedimento Preparar uma suspensão celular na concentração de 0,5X105 células/mL: a) Retirar o meio de cultura da garrafa

b) Lavar a garrafa com PBS c) Adicionar a tripsina

d) Esperar a tripsina reagir e) Preparo do meio de inativação

f) Inativar a tripsina g) Divisão do conteúdo da garrafa em dois tubos falcon

h) Centrifugar as células i) Retirar meio com tripsina

j) Ressuspender as células em meio simples

k) Contar as células Nº céls/mL= nº céls contadas/4 x diluição da câmara X diluição amostra Nº céls /mL=nº céls contadas/4 x 104 X 10

l) Preparar suspensão 0,5 X105 células por mL 200 µl/ poço X 96 poços = 19,2 mL Contagem de células: 5 X 105 células/mL Número de células necessárias: 0,5 X105 células – 1000µl X - 19200µl X= 9,6 X105 células Quantos µl da suspensão celular terá 9,6 X105 células? 5 X105 células – 1000µl 9,6X105 células- X X= 1920µl

5 X105 células – 1000µl 0,5 X105 células - X X= 100µl 100µl (0,5 X105 células) – 1000µl X - 19200µl X= 1920 Suspensão utilizada para o teste: Precisaremos de 19.200 µl 1920µl de soro 192µl de antibiótico 1920µl da suspensão celular 15168µl de meio

Preparo da suspensão celular Adicionar 200µl da suspensão celular em cada poço

Retirar o meio de cultura 24h Retirar o meio de cultura 24, 48 ou 72 h TRATAMENTO

Doxorrubicina (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 µg/mL) Solução mãe (1000µg/mL) 100µg/mL 1800µL meio 50µg/mL 1000µL meio 25µg/mL 1000µL meio 12,5µg/mL 1000µL meio 1000µL 1000µL 6,25µg/mL 1000µL meio 3,125µg/mL 1000µL meio

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H CTRL 100 50 25 12,5 6,25 3,125 CTRL 100 50 25 12,5 6,25 3,125 CTRL 100 50 25 12,5 6,25 3,125

Retirar o meio de cultura 24h Retirar o meio de cultura 24, 48 ou 72 h TRATAMENTO

O que vocês vão fazer!!! Preparar solução MTT Retirar o meio Lavar os poços 2X com PBS Adicionar DMSO 5’ 2h Estabilização da cor 540 nm 5’

V= 1mL da solução estoque Preparo da solução de MTT (0,5mg/mL) Preparo da solução estoque a 5mg/mL Pesar 5mg de MTT Solubilizar em 1,0 mL de PBS estéril. b) Preparo da solução de uso (0,5mg/mL) CV=CV 5mg/mL X V = 0,5mg/mL X 10 mL V= 1mL da solução estoque + 9 mL de meio completo 900µl de soro + 90µl de antibiótico + 8010µl de meio

O que vocês vão fazer!!! Preparar solução MTT Retirar o meio Lavar os poços 2X com PBS Adicionar DMSO 5’ 2h Estabilização da cor 5’ 540 nm

Cálculos Descontar o branco ! Considerar o controle como 100% de células viáveis e fazer regra de três para determinar a viabilidade celular das amostras Fazer a média da absorbância