Métodos envolvendo Ácidos Nucleicos: Métodos Analíticos em Biotecnologia Métodos envolvendo Ácidos Nucleicos: Extração e quantificação; Enzimas de modificação; Marcação; Hibridizações Moleculares; Desenho de iniciadores; PCR de várias modalidades; Clonagem gênica; Sequenciamento gênico; Genômica e bioinformática;

Precisamos de um novo olhar para o básico conhecido na estrutura dos ácidos nucleicos para compreender os métodos com mais facilidade

BASES NITROGENADAS Purinas Pirimidinas 5-Metildicetopirimidina

Base-Pareamento nos ácidos nucleicos

Bases nitrogenadas e ABSORÇÃO DE LUZ U.V.

DOSAGEM DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR ABSORÇÃO DE LUZ U.V. D.O 260nm = 1,0 corresponde a 50g/mL de DNA dupla fita 40 g/mL de DNA ou RNA simples fita 20 g/mL de oligonucleotídeos. D.O 260nm/ D.O 280nm : fornece a pureza de uma preparação de ácidos nucleicos (1,8 e 2,0 para DNA e RNA respectivamente). Valores inferiores indicam contaminação com fenol e proteínas.

Purificação de DNA por gradiente de Cloreto de Césio e visualização por luz U.V. O CsCl tem sua solução aquosa com uma gravidade específica próxima a do DNA . Quando esta solução é centrifugada por um longo período de tempo e em alta velocidade, atinge-se um equilíbrio com a formação de um gradiente de densidade contínuo, com a porção mais concentrada de CsCl no fundo do tubo e a porção menos concentrada no topo.

Tratamento ácido: depurinação

MARCAÇÃO NÃO RADIOATIVA DO DNA VIA BASES NITROGENADAS DIGOXIGENINA: O DNA é marcado com o glicosídeo digoxigenina-11-UTP BIOTINA: O DNA é marcado com biotina COMPOSTOS FLUORESCENTES: O DNA é marcado com compostos fluorescentes como Texas Red.

dUTP-Digoxigenina dUTP- Biotina

AÇÚCARES DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Ligação P-O sensível a alkali e enzimas

Grupamentos Fosfatos nos ácidos nucleicos

dATP

α  β As sondas genéticas podem ser produzidas pelo emprego de nucleotídeos marcados com radiosótopos no fosfato α, por exemplo α 32P .

Ligações Fosfodiéster Ligações fosfodiéster constituem o núcleo principal da vida já que são parte da constituição básica de todos os ácidos nucleicos. A hidrólise das ligações fosfodiester são catalisadas pelas fosfodiesterases (quebra do DNA)

Etanol e isopropanol: A natureza higroscópica do DNA forma precipitados quando colocado em presença de etanol ou isopropanol e pequenas concentrações de cátions monovalentes.

A: desidratada B: Helicoidal alongada Laboratório de Biofísica do Kings College Química de formação : Rosalind Franklin (1920-1958): Novembro de 1951- Cadeia de fosfato-desoxiribose no exterior com bases no interior havendo entre 2 e 4 hélices co-axiais.

Maurice Wilkins 15/12/1916- 05/10/2004

25 de abril de 1953 - Prêmio Nobel em 1962 junto com Maurice Wilkins) Uma estrutura de ferro e madeira, imitando uma hélice dupla, foi a forma que os biólogos James Watson e Francis Crick encontraram para demonstrar como é a forma da molécula de DNA.

Grupos fosfatos das ligações fosfodiester são carregados negativamente

Por quê o mesmo tamanho molecular pode migrar diferentemente no gel de eletroforese?

Estrutura e propriedades dos RNAs 80% do material genético das células: rRNA 15%: tRNA 5%: mRNA 2%: sn RNA e scRNA Regiões dupla fita (Pontes de H) são rompidas por altas temperaturas e calor (como no DNA!) Ligações fosfodiester são rompidas por alkalis (NÃO OCORRE NO DNA!!!!)

mRNA RNA polimerase II: Transcreve os genes do mRNA (e também o snRNA).

Ribosomos são compostos por moléculas de RNA e proteínas formando grandes complexos que compreendem a maior parte da massa de uma célula. O ribossomo tem um coeficiente de sedimentação de 70S, e pode ser dividido em duas subunidades: 50S e 30S. Estas subunidades são compostas por unidades separadas: a subunidade 50S possui 2 moléculas de RNA, uma de 23S e outra de 5S bem como 34 proteínas diferentes. A subunidade 30S tem como subunidades a molécula de rRNA de 16S e 21 proteínas diferentes.

rRNA RNA polymerase I (Pol I): Transcreve os genes do rRNA dos precursores 23S e 16S RNA polymerase III (Pol III): Transcreve os genes para o rRNA 5S

tRNA RNA polymerase III (Pol III): Transcreve os genes para os tRNAs.