Análise do Líquido CéfaloRaquidiano (LCR) Prof. MS. Maurício A. Gomes Heleno

Objetivos Didáticos Aprender como se colhe o LCR; Descrever a aparência do LCR normal e do infeccioso; Definir xantocromia e dizer seu significado; Diferenciar as características hemorrágicas do LCR para definição de HIC ou colheita traumática; Contagem celular total e diferencial

Referências Bibligráficas STRASINGER, SK. Uroanálise e fluidos biológicos. 3o edição Ed. Premier Ltda., 2000. MOTTA, VT. Bioquímica Clínica: Princípios e Interpretações. 5a ed. Medbook, 2009.

Colheita de Amostras O LCR é colhido, normalmente, por punção lombar (entre a3a. e a 4a. ou entre a 4a. e a 5a. vértebra lombar. Amostra colhida em 3 tubos estéreis marcados 1, 2 e 3. Tubo 1: análise bioquímicas e sorológicas Tubo 2: análise microbiológica Tubo 3: contagem celular

Após as análises em cada tubo, os sobrenadantes podem ser reunidos em um “pool” e congelados para posteriores análises bioquímicas e sorológicas A amostra para contagem de células deve ser refrigerada, caso a contagem não seja feita em uma hora. A amostra para a microbiologia deve ser mantida à temperatura ambiente e analisada o mais depressa possível.

Características do LCR Aparência: Normalmente cristalina, pode fornecer informações diagnósticas importantes. Cristalina Opaca ou turva Leitosa Xantocrômica Sanguinolenta

Amostra opaca, turva ou leitosa pode indicar hiperproteinorraquia, alta concentração de lipídios ou leucócitos (infecção). Cuidado!!!! As amostras podem ser extremamente contagiosas. Durante o manejo usar luvas, máscara e óculos. Centrifugar em tubos fechados

Xantocromia indica coloração rosada, laranja ou amarela. Normalmente indica a presença de produtos de degradação dos eritrócitos. Varia de cor em função da quantidade sangue e do tempo que este permanecer no LCR.

Rosa: quantidade muito pequena de oxi-hemoglobina; Laranja: forte hemólise; Amarela: conversão da oxi-hemoglobina e bilirrubina não-conjugada. Outras causas da xantocromia: niveis séricos de bilirrubina elevados, caroteno, hiperproteinorraquia, melanoma.

Punção Traumática Se o LCR estiver muito sanguinolento: Hemorragia Intracraniana (HIC) Acidente de punção (Punção Traumática-PT) Determinação da causa por meio de 3 exames visuais das amostras colhidas:

1- Distribuição desigual do sangue: HIC causa distibuição uniforme nos 3 tubos; PT causa maior concentração no tubo 1. 2- Formação de coágulos: HIC: sg não tem fibrinogênio suficiente para formar coágulos. Lesões na BHE permitem a presença de coágulos, mas o aspecto do LCR não é sanguinolento; PT pode formar coágulos (fibrinogênio plasmático)

3- Sobrenadante xantocrômico: HIC: hemácias por mais de 2 horas no LCR => hemólise PT: não há tempo para hemólise. Falso positivo por introdução de proteínas séricas no LCR.

Observação da xantocromia em LCR sanguinolento: Centrifugar em tubo de micro-hematócrito Examinar contra fundo branco A presença de macrófagos com hemácias fagocitadas é um dado seguro de hemorragia intracraniana

Contagem Celular Leucócitos são encontrados rotineiramente no LCR. A presença e significado das hemácias no LCR => Aparência da amostra. A contagem celular deve ser feita imediatamente (granulócitos e hemácias lisam-se em uma hora e 40% dos leucócitos desintegram-se depois de duas horas.

LCR de um adulto normal => 0 a 5 leucócitos /mL; Mais elevado em crianças e em recém-nascidos encontra-se até 30 células mononucleares/ mL Amostras com até 200 leucócitos ou 400 hemácias/ mL são transparentes, portantos todas as amostras devem ser analisadas ao microscópio

Câmara de Fuchs-Rosenthal A câmara de Fuchs-Rosenthal apresenta uma área de contagem quadriculada que consiste de um quadrado de 4mm x 4mm. Esta área de 16mm² está dividida em 16 quadrados de 1mm².

1mm 4 mm

Cada quadrado de 1mm² está sub-dividido em 16 pequenos quadrados de 1/16mm².

A lamínula é posicionada para que cubra ambas as áreas quadriculadas da câmara de contagem. A lamínula confina o líquido na câmara e regula a profundidade do líquido. A profundidade é 0,2mm. O volume é 3,2 mm3 (16mm² x 0,2mm).

Cálculos para a Câmara de Fuchs-Rosenthal Se toda a área quadriculada for contada sem diluição da amostra, dividir o número final de células contadas por 3,2. Células/μL= nº de células contadas x diluição 3,2

Como encher a câmera de contagem A lamínula para câmera de contagem previamente limpa é posicionada de tal modo que cubra ambas as áreas quadriculadas da câmera de contagem. A câmera é preenchida tocando a ponta de uma micropipeta ou tubo capilar no ponto onde a lamínula e a plataforma se encontram em um lado.

Como contar as células Contar da esquerda para direita e da direita para a esquerda (como uma serpente). Se os quadrados estiverem limitados por linhas triplas o limite é a linha central, e se estiverem limitados por linhas duplas o limite é a linha externa. Contar as que tocam o limite inferior e direito.

A área quadriculada fica mais visível quando o condensador é baixado e a intensidade da luz diminuída. Girar para a objetiva de 40x cuidadosamente. Sempre que for remover a câmera de contagem girar para a objetiva 10x.

Contagem diferencial A identificação dos tipos celulares presentes no LCR é de grande valor diagnóstico. A contagem diferencial deve ser feita em um esfregaço corado e não na câmara de contagem devido a possibilidade de observação de células anormais com importância diagnóstica.

A contagem diferencial na própria câmara de contagem só deve ser feita quando a quantidade de LCR for insuficiente. A amostra deve ser concentrada antes da preparação do esfregaço por um dos métodos abaixo: Filtração Sedimentação Citocentrifugação Centrifugação comum

Após a centrifugação, retira-se o sobrenadante para outros exames, deixando apenas uma pequena quantidade para ressuspender as células. Após a concentração e ressuspensão da amostra, faz-se um esfregaço seco ao ar e corado (Leishman, Wright)

Na contagem diferencial devem ser contadas 100 células, que serão classificadas e registradas em termos de porcentagem. Se o número de células for baixo e não for possível contar 100 células, registra-se apenas o número de tipos celulares encontrados

Relação entre a contagem na câmara e na amostra centrifugada Esfregaço 0-40 1-5 20-100 6-10 60-150 11-20 150-250 20 250 Fonte: Strasinger

Significado das células normais O LCR normal apresenta principalmente Linfócitos e Monócitos (70:30 nos adultos), mas também alguns Neutrófilos. Nas crianças predominam os monócitos.

Com o número de leucócitos aumentado, a contagem diferencial fornece informações diagnósticas sobre o tipo do M.O. causador da infecção. A presença de um grande número de neutrófilos pode indicar meningite bacteriana. Se a contagem de linfócitos e monócitos for alta, há indício de meningite viral, tuberculosa, fúngica ou parasitária

Uma contagem celular (leucócitos) muito baixa – menos de 25 células por mm3 - com grande número de linfócitos é indício de Esclerose Múltipla.

Significado das células anormais Considera-se anormal a presença de um número elevado de neutrófilos (pleocitose), assim como a presença de leucócitos imaturos, eosinófilos, plasmócitos, macrófagos, células teciduais (plexo coróide, ependimárias e malignas)

Macrófagos aparecem de 2-4 horas após a introdução de hemácias no LCR ou após punções repetidas. A presença de um grande número de macrófagos com hemácias fagocitadas é indicativo de hemorragia prévia (HIC)

Eosinófilos em grande número podem indicar infestação parasitária (neurocisticercose) ou reações a proteínas estranhas no LCR.

A pesquisa de bandas oligoclonais no líquor tem grande importância no diagnóstico e no seguimento de processos inflamatórios do sistema nervoso central (SNC).

Essas bandas são imunoglobulinas sintetizadas por um ou poucos clones de plasmócitos, derivados de linfócitos B, em resposta à presença contínua de um antígeno único e altamente específico. Podem ser encontradas em mais de 90% dos pacientes com esclerose múltipla, mas não constituem indícios exclusivos dessa doença.