CRESCIMENTO MICROBIANO Profa. Karina Ponsoni Corbi
1. Fatores necessários para o crescimento - Fatores Físicos ( temperatura, pH, pressão osmótica) - Fatores Químicos (nutrientes, água, O2 etc.) 2. Meio de Cultura - Meio Complexo - Meio Definido 3. Crescimento da cultura bacteriana - Quantificação Direta (nº. de colônias viáveis ou não) - Quantificação Indireta (turbidez, peso seco etc.)
CRESCIMENTO MICROBIANO: Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do número de células e não ao aumento das dimensões celulares. Crescimento Microbiano = associado ao crescimento de uma população de células (uma célula dará origem a duas ao fim de um certo tempo, tempo de geração ou de duplicação.)
FATORES NECESSÁRIOS PARA O CRESCIMENTO - FATORES FÍSICOS:. TEMPERATURA FATORES NECESSÁRIOS PARA O CRESCIMENTO - FATORES FÍSICOS: TEMPERATURA PH PRESSÃO OSMÓTICA (CONCENTRAÇÃO DE SAL) - FATORES QUÍMICOS: ÁGUA FONTES DE CARBONO E NITROGÊNIO MINERAIS OXIGÊNIO FATORES ORGÂNICOS
FATORES FÍSICOS 1. TEMPERATURA: A maioria dos microrganismos cresce bem nas temperaturas ideais para os seres humanos. - Temperatura de crescimento mínima: < temperatura onde a espécie é capaz de crescer - Temperatura de crescimento ótima: onde a espécie apresenta melhor crescimento - Temperatura de crescimento máxima: > temperatura, onde ainda é possível o crescimento Figura 1
Figura 1. Taxa de crescimento vs. temperatura
FATORES FÍSICOS 1. TEMPERATURA: MICRORGANISMOS SÃO CLASSIFICADOS EM 3 GRUPOS: - PSICRÓFILOS: CRESCEM EM BAIXAS TEMPERATURAS (-10 A 15 °C) - MESÓFILOS: CRESCEM EM TEMPERATURAS MODERADAS (10 A 50 °C) - TERMÓFILOS: CRESCEM EM ALTAS TEMPERATURAS (40 A 70 °C) TERMÓFILOS EXTREMOS (68 A 110 °C) Figura 2
Termófilos extremos Figura 2. Curva de crescimento característica de diferentes microrganimos
Área de Alimentos Psicrófilos: temperatura ótima: 15 °C encontrados em oceanos e regiões da Ártica não causam problemas na preservação de alimentos Psicrotróficos: temperatura ótima: 20 a 30 °C crescem em temperatura de refrigeradores (4 °C) encontrados em alimentos estragados Mesófilos: temperatura ótima: 25 a 40 °C (mais encontrados) corpo de animais (temperatura da pele) bactérias patogênicas: temp. ótima 37 °C degradam alimentos e são patogênicos Termófilos: temperatura ótima: 50 a 60 °C ambiente de águas termais (***não crescem em temp. < 45 °C) material estocado (altas temp.)= compostagem
FATORES FÍSICOS 2. PH: - REFERE-SE A ACIDEZ OU A ALCALINIDADE DE UMA SOLUÇÃO; - MAIORIA DOS MICRORGANISMOS CRESCE MELHOR PERTO DA NEUTRALIDADE (PH 6,5 – 7,5); - POUCAS BACTÉRIAS SÃO CAPAZES DE CRESCER EM PH ÁCIDO (COMO PH 4,0) BACTÉRIAS: FAIXA ENTRE PH 7,0 EXCEÇÕES: - BACTÉRIAS ACIDÓFILAS: ALTO GRAU DE TOLERÂNCIA À ACIDEZ (THIOBACILLUS DE 0,5 A 6,0 COM ÓTIMO ENTRE 2 E 3,5) - BACTÉRIAS ALCALIFÍLICAS: (BACILLUS E ARCHAEA) (PH 10 – 11). FUNGOS - TENDEM A SER MAIS ACIDÓFILOS QUE AS BACTÉRIAS (PH <5). Figura 3
(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) Figura 3. Distribuição de alguns microrganismos de acordo com o pH (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)
FATORES FÍSICOS 3. PRESSÃO OSMÓTICA: OS MICRORGANISMOS RETIRAM DA ÁGUA A MAIORIA DOS NUTRIENTES SOLÚVEIS (CONTEÚDO CELULAR 80 – 90 % DE ÁGUA) PRESSÃO OSMÓTICA: RETIRA A H2O DENTRO DA CÉLULA REAÇÃO HIPERTÔNICA: PERDA DE H2O DO MEIO INTRACELULAR PARA O EXTRACELULAR, ATRAVÉS DA MEMBRANA PLASMÁTICA (MEIO COM CONCENTRAÇÃO DE SAIS). PLASMÓLISE: DIMINUIÇÃO DA MEMBRANA PLASMÁTICA DA CÉLULA DEVIDO A PERDA DE H2O POR OSMOSE. Figura 4
Não Halófilos: não necessitam de sal e não toleram a presença no meio. Halotolerantes: não necessitam de sal mas toleram a presença no meio. Halófilos: necessitam de sal em uma concentração moderada Halófilos extremos: necessitam de sal em altas concentrações. Figura 4. Taxa de crescimento de alguns microrganimos vs. a concentração de sal.
de sais para o crescimento Halofílicos Facultativos: mais abundantes Área de Alimentos adição de sais: plasmólise preservação de alimentos (peixe salgado, mel e leite) Alta concentração de sal ou açúcar Halofílicos Extremos (ou obrigatórios): necessitam de altas concentrações de sais para o crescimento Halofílicos Facultativos: mais abundantes não exigem altas concentrações de sais Adição de ágar: normalmente 1,5% para solidificar o meio > concentração = inibição de alguns microrganismo > concentração de sal = pressão osmótica
FATORES QUÍMICOS 1. ÁGUA: - ESSENCIAL PARA OS MICRORGANISMOS - DISPONIBILIDADE VARIÁVEL NO AMBIENTE AMBIENTE COM < CONCENTRAÇÃO DE ÁGUA: DESENVOLVEM MECANISMOS PARA OBTER ÁGUA ATRAVÉS DO AUMENTO DA CONCENTRAÇÃO DE SOLUTOS INTERNOS SEJA PELO BOMBEAMENTO DE ÍONS PARA O INTERIOR CELULAR OU PELA SÍNTESE DE SOLUTOS ORGÂNICOS (AÇÚCARES, ÁLCOOIS OU AMINOÁCIDOS).
FATORES QUÍMICOS 2. FONTES DE CARBONO, NITROGÊNIO, ENXOFRE E FÓSFORO: A) CARBONO: ESSENCIAL PARA A SÍNTESE DE TODOS OS COMPOSTOS ORGÂNICOS NECESSÁRIOS PARA A VIABILIDADE CELULAR (ELEMENTO ESTRUTURAL BÁSICO PARA OS SERES VIVOS) ORGANISMOS QUIMIO-HETEROTRÓFICOS: OBTÉM C A PARTIR DE MATERIAIS ORGÂNICOS COMO PROTEÍNAS, CARBOIDRATOS E LIPÍDEOS. ORGANISMOS QUIMIO-AUTOTRÓFICOS ORGANISMOS FOTOAUTOTRÓFICOS C a partir de CO2
B) NITROGÊNIO, ENXOFRE E FÓSFORO: - N, S: SÍNTESE DE PROTEÍNAS - N, P: SÍNTESE DE DNA E RNA, ATP PESO SECO DE UMA CÉLULA BACTERIANA: 14 % N, 4 % S, P NITROGÊNIO - UTILIZADO PARA SINTETIZAR OS GRUPOS AMINOS PRESENTES NOS AMINOÁCIDOS. Obtenção de N: - Decomposição de materiais orgânicos (proteínas, aminoácidos) Amônia (NH4 +) Nitrato (NO3-)
Bactérias Fixadoras de Nitrogênio Fixação de N: algumas bactérias são capazes de utilizar N gasoso diretamente da atmosfera. Microrganismos do solo (ex. bactérias dos gêneros Rhizobium e Bradyrhizobium) utilizam este processo para obtenção de N, tanto para elas como para as plantas que convivem simbioticamente (algumas leguminosas – soja, feijão). Cultivo de leguminosas: > fertilidade do solo sem a necessidade de implementação de fertilizantes químicos
Fontes naturais de S: íon sulfato (SO4-2), sulfito de hidrogênio, aminoácidos ENXOFRE - utilizado na síntese de aminoácidos contendo S e de vitaminas (tiamina e biotina). FÓSFORO - essencial para a síntese dos ácidos nucléicos e para os fosfolipídeos componentes da membrana celular. Fontes naturais de P: íon fosfato (PO4-3), DNA, RNA, ATP
C) POTÁSSIO, MAGNÉSIO E CÁLCIO: - TAMBÉM SÃO ELEMENTOS ESSENCIAIS PARA OS MICRORGANISMOS - FREQÜENTEMENTE ENCONTRADOS COMO CO-FATORES PARA AS REAÇÕES ENZIMÁTICAS. D) ELEMENTOS TRAÇOS: - FERRO, COBRE, MOLIBDÊNIO, ZINCO - UTILIZADOS COMO CO-FATORES ESSENCIAIS PARA ATIVIDADE DE ALGUMAS ENZIMAS UTILIZAR ÁGUA DESTILADA PARA MEIO DE CULTURA – CONTÉM TODOS OS ELEMENTOS TRAÇOS
FATORES QUÍMICOS 3. OXIGÊNIO: - EXTREMAMENTE IMPORTANTE NO DESENVOLVIMENTO MICROBIANO - ORGANISMOS CLASSIFICADOS EM: 1. AERÓBIOS Estritos (obrigados): necessitam de O2 Facultativos: não necessitam de O2 mas crescem melhor com O2 Microaerófilo: necessitam de O2 mas em níveis menores 2. ANAERÓBIOS Aerotolerantes: não necessitam de O2 mas crescem melhor sem O2 Estritos (obrigados): não toleram O2 (letal) Figura 5
ANAERÓBIO AEROTOLERANTES ESTRITOS alta [O2] catalase SOD ANAERÓBIO ESTRITO sem O2 ausência: catalase MICRO AERÓFILO baixa [O2] AERÓBIO FACULTATIVO alta e baixa [O2] ANAERÓBIO AEROTOLERANTES Catalase e a superóxido dismutase reduzem para H2O os compostos tóxicos. Figura 5. Efeito do oxigênio sobre o crescimento de vários tipos de bactérias.
MEIO DE CULTURA MEIO DE CULTURA: MATERIAL NUTRIENTE PREPARADO NO LABORATÓRIO PARA O CRESCIMENTO DE MICRORGANISMOS. CULTURA: MICRORGANISMOS QUE CRESCEM E SE MULTIPLICAM NO MEIO DE CULTURA. MEIO DEFINIDO: TODA A COMPOSIÇÃO QUÍMICA É CONHECIDA MEIO COMPLEXO: COMPOSIÇÃO QUÍMICA NÃO CONHECIDA (COMPOSTO POR NUTRIENTES COMO EXTRATO DE LEVEDURA, DE CARNE OU DE PLANTAS)
MEIO DE CULTURA MEIO DE CULTIVO SELETIVO E DIFERENCIAL: - meio seletivo: favorece o crescimento de uma determinada bactéria de interesse, impedindo o crescimento de outras bactérias. Agar MacConkey: bactérias gram-negativas fermentadoras e não fermentadoras de lactose, respectivamente
- meio diferencial: facilita a identificação de um determinado organismo. Ex: Ágar Manitol Salgado, utilizado para a identificação de Staphylococcus aureus (colônias amarelo ouro). Staphylococcus aureus em ágar Manitol Salgado
MEIO DE CULTURA MEIO DE ENRIQUECIMENTO: FAVORECE O DESENVOLVIMENTO DE UMA POPULAÇÃO BACTERIANA QUE ESTÁ EM DESVANTAGEM ENTRE OUTRAS POPULAÇÕES. MEIOS REDUTORES: MEIOS COM REAGENTES, COMO O TIOGLICOLATO DE SÓDIO, QUE É CAPAZ DE SE COMBINAR COM O OXIGÊNIO DISSOLVIDO ELIMINANDO ESTE ELEMENTO DO MEIO DE CULTURA (ESPECÍFICO PARA MICRORGANISMOS ANAERÓBICOS).
CRESCIMENTO DAS CULTURAS BACTERIANAS - DIVISÃO BACTERIANA: CRESCIMENTO DAS CULTURAS BACTERIANAS - DIVISÃO BACTERIANA: - FISSÃO BINÁRIA - BROTAMENTO - TEMPO DE GERAÇÃO: - FASES DE CRESCIMENTO: - FASE LAG - FASE LOG - FASE ESTACIONÁRIA - FASE DE MORTE CELULAR
CRESCIMENTO DAS CULTURAS BACTERIANAS DIVISÃO BACTERIANA: É CONSIDERADO O AUMENTO DO NÚMERO DE INDIVÍDUOS E NÃO DO TAMANHO CELULAR. 1. BROTAMENTO: < Nº DE BACTÉRIAS (FORMA UM BROTO QUE QUANDO ATINGE O TAMANHO DA CÉLULA PARENTAL SE SEPARA) 2. FISSÃO BINÁRIA: (1) ALONGAMENTO DA CÉLULA E A REPLICAÇÃO DO DNA CROMOSSOMAL; (2) INÍCIO DA INVAGINAÇÃO DA PAREDE CELULAR E DA MEMBRANA PLASMÁTICA; (3) EM UM DETERMINADO MOMENTO, AS DUAS SEÇÕES DA PAREDE CELULAR DE ENCONTRAM; (4) PRODUÇÃO DE DUAS CÉLULAS INDIVIDUAIS IDÊNTICAS À CÉLULA MÃE. Figura 6
Figura 6. Fissão binária bacteriana. (Adaptado de Tortora, G.J., et al., Microbiology,2003)
CRESCIMENTO DAS CULTURAS BACTERIANAS TEMPO DE GERAÇÃO: É O TEMPO NECESSÁRIO PARA UMA CÉLULA SE DIVIDIR (E SUA POPULAÇÃO DOBRAR DE TAMANHO). - TEMPO VARIA DE ACORDO COM O ORGANISMO; - DEPENDE DAS CONDIÇÕES AMBIENTAIS (NUTRICIONAIS, TEMPERATURA, ETC); - MAIORIA DAS BACTÉRIAS: 1 – 3 H
FASES DE CRESCIMENTO CURVA DE CRESCIMENTO: DEMONSTRA O CRESCIMENTO DAS CÉLULAS DURANTE UM PERÍODO DE TEMPO. CURVA DE CRESCIMENTO OBTIDA PELA CONTAGEM DA POPULAÇÃO EM INTERVALOS DE TEMPO APÓS UM INÓCULO DE UM NÚMERO PEQUENO DE BACTÉRIAS EM MEIO DE CULTURA. FASE lag: pouca ou ausência de divisão celular (fase de adaptação) - ≥ 1 hora (estado de latência, com intensa atividade metabólica) FASE log: início do processo de divisão (período de crescimento ou aumento logarítmo) (reprodução celular extremamente ativa, sensíveis as mudanças ambientais - * EFEITO DE ANTIBIÓTICOS) FASE ESTACIONÁRIA: velocidade de crescimento diminui nº de células vivas = nº de células mortas FASE DE MORTE CELULAR: nº de células mortas excede o de células novas. Figura 7
Figura 7. Curva de crescimento bacteriano mostrando as 4 fases típicas.
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO QUANTIFICAÇÃO DIRETA: MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO QUANTIFICAÇÃO DIRETA: - CONTAGEM EM PLACAS - FILTRAÇÃO - MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL - CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO QUANTIFICAÇÃO INDIRETA: - TURBIDIMETRIA - ATIVIDADE METABÓLICA - PESO SECO
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO QUANTIFICAÇÃO DIRETA: (1) CONTAGEM EM PLACAS - TÉCNICA MAIS UTILIZADA NA DETERMINAÇÃO DO TAMANHO DA POPULAÇÃO BACTERIANA; VANTAGEM: QUALIFICAÇÃO DE CÉLULAS VIÁVEIS DESVANTAGEM: TEMPO (24 H PARA O APARECIMENTO DAS COLÔNIAS) Figura 8
Figura 8. Contagem em placas e diluição seriada Cálculo: nº de colônias na placa x índice de diluição da amostra = nº de bactérias/mL DILUIÇÃO SERIADA MÉTODO DE ESPALHAMENTO EM PLACA Figura 8. Contagem em placas e diluição seriada
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO QUANTIFICAÇÃO DIRETA: (2) FILTRAÇÃO - < Nº DE BACTÉRIAS = PODE SER UTILIZADO O MÉTODO DE FILTRAÇÃO PARA A SUA CONTAGEM. - CONCENTRAÇÃO DE BACTÉRIAS SOBRE A SUPERFÍCIE DE UMA MEMBRANA DE FILTRO DE POROS MUITO PEQUENOS APÓS A PASSAGEM DE UM VOLUME DE 100 ML DE ÁGUA. - FILTRO POSTERIORMENTE TRANSFERIDO PARA UMA PLACA DE PETRI CONTENDO MEIO SÓLIDO.
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO QUANTIFICAÇÃO DIRETA: (3) O MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) - UTILIZADO PARA MICRORGANISMOS QUE NÃO CRESCEM BEM EM MEIO SÓLIDO. A) DILUIÇÃO A PARTIR DE UM ALTO VOLUME DE INÓCULO (EX. 10 ML) B) DILUIÇÃO A PARTIR DE UM MÉDIO VOLUME DE INÓCULO (EX. 1 ML) C) DILUIÇÃO A PARTIR DE UM BAIXO VOLUME DE INÓCULO (EX. 0,1 ML) D) CONTAGEM DO Nº DE TUBOS POSITIVOS E) ESTIMATIVA DO Nº DE CÉLULAS/ML DE BACTÉRIAS Figura 9
Figura 9. Método do número mais provável (NMP) 10 mL de inóculo 1 mL de inóculo 0,1 mL de inóculo 6 tubos positivos (com crescimento bacteriano) 3 tubos positivos 1 tubos positivos Figura 9. Método do número mais provável (NMP)
Figura 9. Método do número mais provável (NMP) 6 3 1 Tabela de combinações (NMP) 6-3-1 Índice de NMP/100 mL = 110 Inferior = 40 Superior = 300 Confiabilidade de 95% Figura 9. Método do número mais provável (NMP)
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO QUANTIFICAÇÃO DIRETA: (4) CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO - UM VOLUME CONHECIDO DE SUSPENSÃO BACTERIANA É COLOCADO EM UMA ÁREA DEFINIDA DA LÂMINA DE MICROSCÓPIO. - A AMOSTRA PODE SER CORADA OU ANALISADA A FRESCO. - UTILIZAM CÂMARAS DE CONTAGEM DESVANTAGENS: - NÃO SEPARA CÉLULAS MORTAS E VIVAS - PODE HAVER ERROS DE CONTAGEM - DIFÍCIL CONTAGEM PARA BACTÉRIAS MÓVEIS Figura 10
Figura 10. Utilização da câmara de contagem Petroff-Hausser.
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO QUANTIFICAÇÃO INDIRETA: (1) TURBIDIMETRIA - MONITORAMENTO DO CRESCIMENTO BACTERIANO ATRAVÉS DA TURBIDEZ - ESPECTROFOTÔMETRO (660 NM) (2) ATIVIDADE METABÓLICA - QUANTIDADE DE UM CERTO PRODUTO (COMO ÁCIDO OU CO2) É DIRETAMENTE PROPORCIONAL AO NÚMERO DE CÉLULAS BACTERIANAS. Figura 11
Figura 11. Determinação do nº de bactérias por turbidimetria. A quantidade de luz que atravessa o detector é inversamente proporcional ao nº. de bactérias. Quanto > o nº. de bactérias < a quantidade de luz que é transmitida Figura 11. Determinação do nº de bactérias por turbidimetria.
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO QUANTIFICAÇÃO INDIRETA: (3) PESO SECO - PRINCIPALMENTE PARA FUNGOS FILAMENTOSOS A) FUNGO É REMOVIDO DO MEIO POR FILTRAÇÃO B) SECO EM DESSECADOR C) POSTERIOR PESAGEM.