Aluna: Raíssa Estrela Curado Co-orientadora: Laudiene Meyer Caracterização geral, genética e bioquímica da microalga Neochloris oleoabundans, visando a produção de biodiesel Aluna: Raíssa Estrela Curado Co-orientadora: Laudiene Meyer

Introdução Problemática do carbono - combustíveis fósseis Biodiesel Considerações gerais acerca das microalgas Por que ainda não são utilizadas? Como torná-las utilizáveis? Neochloris oleoabundans Genômica de microalgas Transcriptômica de microalgas Manipulação genética e das condições de cultivo

Problemática do carbono e combustíveis fósseis Introdução Problemática do carbono e combustíveis fósseis Reajustes constantes no preço do barril de petróleo Crise ambiental O longo prazo requerido para a formação de combustíveis fósseis torna todo o processo de uso destes, insustentável escassez das fontes, estimativas sugerem q as reservas de petroleo não devem durar mais q 50 anos. Adicionalmente, a natureza especulativa desse mercado associada a interesses políticos tornam cada vez mais incerta a obtençao do ouro negro para alguns países. Crise ambiental: em um período de 300 anos, a liberação de gases de efeito estufa, principalmente o CO2, aumentou em 100 vezes e a principal fonte desses gases é a queima de combustíveis fósseis principalmente pelo setor de transportes. California Energy Commission, 2004

introdução Biodiesel Emissão vs. Fixação de CO2  neutro curtos prazos para o fechamento do ciclo. Pode substituir total ou parcialmente o petrodiesel em motores automotivos ou estacionários

Biodiesel Mundo  Colza, girassol, soja introdução Mundo  Colza, girassol, soja Brasil  lei 11.097/2005 – Soja 2008 B2 2013 B5 Alemanha responde por mais de 40% da prod mundial. – isençao de impostos. O biod é 12% mais barato q o diesel. Colza – gramínea da família da couve

Problemas... Deslocamento das fronteiras agrícolas EUA: a total substituição do petrodiesel por biodiesel consumido em transporte exigiria que 48% de toda a área cultivável dos EUA fosse voltada exclusivamente para o plantio de palma (Chisti, 2007) Baixa produtividade Baixa eficiência fotossintética Falar do etanol celulosico

Nova vertente: microalgas introdução Nova vertente: microalgas Grande diversidade Unicelulares Altas taxas de crescimento EUA: 2-6% área cultivável Alta eficiência fotossintética Não competem por solos Menor requerimento hídrico 200 a 300X Mais óleo Área 100X menor 50% do co2 atmosférico tem origem em algas.

Por que ainda não são utilizadas? introdução Por que ainda não são utilizadas? Alimentação humana Atualmente, no Brasil  aqüicultura Altos custos implantação Necessidade de melhor desempenho Não há informações da produção em grande escala voltada para a produção de energia, somente existem iniciativas de caráter acadêmico em algumas universidades e, em geral, trabalhando isoladamente.

Como torná-las utilizáveis? introdução Como torná-las utilizáveis? Biorrefinaria EUA, Canadá e Alemanha  colza e soja Aproveitamento total da biomassa Manipulação Condições de cultivo Interferência em vias metabólicas

Neochloris oleoabundans introdução Neochloris oleoabundans Microalga verde – C. reinhardti Revisão bibliográfica (Griffiths e Harrison 2008; Tornabene et al. 1983; Li et al. 2008; Band 1992) Alta produtividade lipídica (32% a 54%) Bom perfil lipídico Pouco estudada oleaginosa Teor de óleo % soja 18-20 girassol 35-45 mamona 45-50 palma amendoim

Genômica de microalgas introdução Genômica de microalgas Espécie Tamanho Status Data Quem Chlamydomonas reinhardtii 120M Draft assembly set/05 Department of Energy's Joint Genome Institute Chlorella sp. NC64A 40M in progress   Chlorella vulgaris Coccomyxa sp. C-169 Dunaliella salina Micromonas pusilla draft assembly fev/08 Ostreococcus 'lucimarinus' 13M jul/08 Ostreococcus sp 12M mai/08 Volvox carteri Nuclear: NCBI  9 Cloroplasto: Chlamydomonas reinhardtii, Chaetosphaeridium globosum, Chlorella vulgaris e Mesostigma viride A espécie mais estudada em termos de genética é a microalga verde C. reinhardtii, Seu genoma conta com 110Mb é bastante utilizada em estudos referentes a processos fotossintéticos, contando com várias ferramentas moleculares já desenvolvidas, como transformação nuclear e plasmidial utilizando vários marcadores.

Transcriptoma de microalgas introdução Transcriptoma de microalgas 21 trabalhos diferentes fotoperíodos (Ledford et al. 2004) situações de privação de nutrientes fósforo (Moseley et al. 2006) enxofre (Nguyen et al. 2008) O brasil apresenta vantagens e competência para implementar essas medidas, porém há 2 fatores principais que tornam a questão preocupante: o deslocamento das fronteiras agrícolas e o baixo rendimento energético das oleaginosas.

Manipulação Cultivo Genética Nitrogênio, silício Manipulação de condições, como o pH, intensidade luminosa, temperatura, agitação Genética 25 espécies  passíveis de transformação genética Técnicas de transformação, genes marcadores selecionáveis, promotores e genes repórteres disponíveis

Objetivos Geral: Caracterização geral, genética e bioquímica da espécie estudada, visando identificar condições ambientais, genes e vias metabólicas com papéis importantes na produtividade lipídica

Fotobiorreator Objetivos B

Caracterização geral Objetivos - privação de nutrientes (nitrogênio) - em presença e ausência de glicose - em diferentes concentrações de CO2 em diferentes intensidades luminosas em diferentes temperaturas ... Condições de cultivo medições de biomassa, produtividade lipídica, eficiência fotossintética e perfil lipídico Condições ótimas!

Caracterização genética Objetivos Caracterização genética Seleção das condições ótimas Extração de DNA Extração de RNA Seqüenciamento Microarray Análise dos dados Análise dos dados Genes alvos Manipulação?

Caracterização Bioquímica Objetivos Caracterização Bioquímica Ativadores/inibidores de fotossíntese e síntese lipídica Medições de atividade enzimática Caracterização de complexos enzimáticos envolvidos nestes processos

Resultados preliminares Chlorella luteo-viridis e Neochloris oleoabundans Meios Curvas de crescimento Microscopia Extraçao de lipidios

Resultados preliminares Meios Chlorella Bristol Proteose Proteose Soil Extract Soil Extract (- Soil + Fe) Bristol Soil Extract modificado BBM O brasil apresenta vantagens e competência para implementar essas medidas, porém há 2 fatores principais que tornam a questão preocupante: o deslocamento das fronteiras agrícolas e o baixo rendimento energético das oleaginosas.

Observações

Resultados preliminares Curvas de crescimento Resultados preliminares Shaker vs. Bancada 10mM NaNo3 vs. 5mM NaNO3

Curvas de crescimento – Agitação

Curvas de crescimento - Nitrogênio

Contagem e pesagem de células Contagem – Neubauer Vs. Abs e peso seco Pesagem – em aprimorando Centrifugação – papel Alumínio – estufa 24h A750nm Peso (g/mL) A750nm Peso (g/mL) Nº cél/mL Nº cél/mL

Microscopia Azul de Toluidina Vermelho neutro AT- nuclear, acidófilo VM- cora lipídios em fluorescencia Azul de Toluidina Vermelho neutro

Próximos passos Extração de lipídios e cromatografia - ok Fotobiorreator Curvas de crescimento em privação de nitrogênio - ok Extração de DNA - ok Curvas de crescimento com glicose …

Obrigada!