SEPARAÇÃO DE PROTEINAS POR CROMATOGRAFIA

Apresentação em tema: "SEPARAÇÃO DE PROTEINAS POR CROMATOGRAFIA"— Transcrição da apresentação:

1 SEPARAÇÃO DE PROTEINAS POR CROMATOGRAFIA
1. Princípio geral da cromatografia a.matriz sólida capaz de reter a molécula alvo b.passagem (forçada ou não) do fluido contendo a molécula alvo através da matriz c.retenção da molécula alvo por certo tempo d.eluição separada dos componentes do fluido e, consequentemente da molécula alvo

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3 Cromatograma e algumas variáveis características
Resolução cromatográfica: (trB – trA) 0,5 (WbA + WbB) RS =

4 - Eficiência da purificação é avaliada pela resolução cromatográfica (RS).
RS = (trB – trA) / 0,5 (WbA + WbB) RS < 1 => separação incompleta RS = 1 => curvas se tocam na base RS > 1 => separação completa * Normalmente a matriz é empacotada numa coluna (leito fixo) ** Variante: adsorção em leito fluidizado. Neste caso há movimento da matriz

5 2. Tipos de cromatografia (quanto à retenção e liberação da molécula, em leito fixo)
2.1 Troca iônica - retenção baseada na carga da superfície da proteina/molécula - mais comum, de grande aplicabilidade (resinas têm alta capacidade de adsorver proteínas) - Tem boa seletividade - Separa a proteina das impurezas - A molécula alvo é eluída com íons de mesma carga que esta, porém com maior força de interação com a fase estacionária

6 - A capacidade total de um trocador é dada pela quantidade de grupos carregados na fase móvel que podem ser trocados por unidade de volume ou massa de matriz. - Ampliação de escala: aumento do volume da coluna (normalmente pelo aumento do seu diâmetro). Critério: velocidade superficial da fase líquida (vazão/área da seção da coluna) Obs.: manter constantes todas as demais variáveis

7 2.2 Gel filtração - Separação por tamanho (volume efetivo) da molécula - Moléculas com volume efetivo maior que o poro são expulsas da coluna no volume espacial (Ve) - Moléculas menores penetram nos poros e em seguida são arrastadas pelo eluente - A separação obedece a sequência de volume efetivo 2.3 Cromatografia hidrofóbica - Retenção da molécula pela interação da sua região hidrofóbica com a matriz - A proteína é colocada num meio com alta concentração de sal

8 - A eluição é feita com um eluente de baixa concentração de sal ou aumentando-se o conteúdo de solvente orgânico - O gel é mais caro que a resina de troca iônica porém mais barato que as matrizes de afinidade 2.4 Focalização isoelétrica - Retenção ocorre num tipo especial de resina de troca iônica que contem grupos químicos que conferem um gradiente de pH - A eluição é feita com um fluido que contem um anfólito especialmente formulado

9 - Permite separar isoproteínas (excelente reso-lução)
- Gel e eluente são caros aplicação nos estágios finais da purificação de produtos de alto valor agregado 2.5 Afinidade - A matriz é formada por um ligante bioespecífico e seletivo

10 O complexo formado entre o ligante e a proteína tem que ser reversível
A molécula alvo é retida e as impurezas são eliminadas Finalmente a proteína é eluída e o ligante regenerado 2.6 Fase reversa - Compreende uma fase estacionária apolar e uma fase móvel de polaridade moderada. - Quanto mais apolar for a molécula alvo maior será o seu tempo de retenção (e vice-versa). - Alterando-se as forças de interação entre as fases móvel e estacionária, promove-se a eluição da molécula alvo. Isto possibilita também regular o seu tempo de retenção.

11 figura

12 3. Cromatografia em leito fluidizado
Baseia-se na movimentação da matriz Útil para purificar proteínas de soluções contendo ou não material particulado (células suspensas ou fragmentos), uma vez que permite integrar as etapas de clarificação e purificação grande interesse

13 Ideal para os casos em que não se aplica o sistema de leito empacotado e para reduzir perda por ação de proteases (redução de tempo) Por exemplo, proteínas heterólogas sintetizadas por E. coli estão frequentemente num meio que apresenta elevada viscosidade e contem fragmentos da parede da bactéria, características que o tornam inadequado para uma centrifugação e cromatografia em leito empacotado.

14 Os ligantes clássicos SP – sulfapropil, DEAE – dietil aminoetil – e IDA – ácido iminodiacético - para adsorção por troca iônica, IgG - para adsorção por afinidade e Streamline Phenyl - para adsorção por hidrofobicidade, são acoplados ao suporte das partículas adsorventes (agarose-quartzo ou agarose-metal) elevando sua densidade, e viabilizando a expansão do leito

15 Tipos de reatores contendo o meio adsorvente suspenso:
Reator agitado (mais simples) Processo clássico é o CARE (“Continuous Adsorption Recycle Extraction”) Reator expandido

16 Reator agitado

17 Características dos fluidos
F1 (sup.) = solução tampão contendo a molécula alvo, sob condições favoráveis à adsorção F1 (inf.) = descarte - fase líquida rica em conta-minantes e pobre em molécula alvo F2 (sup.) = alimentação do tampão de eluição F2 (inf.) = solução rica em molécula alvo F3 (dir.) = suspensão do adsorvente, rico em molécula alvo, que alimenta o segundo reator F3 (esq.) = suspensão do adsorvente reciclado do segundo reator

18 Reator expandido Analisar F1, F2 e F3 sob ponto de vista de vazão
O material adsorvente (sólido) tem uma densidade maior que a do líquido (eluente) que, por ser aplicado a uma velocidade superficial adequada, faz com que o leito sofra expansão

19 Esquema ilustrativo das etapas da adsorção em leito expandido.

20 Variáveis importantes (para Leito expandido)
A expansão do leito e os fatores a ela associados interferem na ligação proteína-adsorvente Velocidade superficial do fluido (U), velocidade terminal da partícula (UT), porosidade () e índice de expansão (n) do leito

21 n é função do número de Reynolds
A velocidade superficial do fluido (U), também chamada de velocidade linear, é definida por: Onde Q é a vazão de alimentação do leito (m3/h) e A é a área da seção transversal da coluna (m2).

22 A velocidade linear varia entre 100 e 300 cm/h nas operações de expansão, aplicação do meio e lavagem. Na operação de eluição a velocidade linear é reduzida para cerca de 100 cm/h, o que eleva a concentração da molécula alvo no eluído. Outras variáveis: - Grau de expansão do leito (GE = H/Ho) H: altura do leito em repouso Ho: altura do leito expandido valores típicos de GE: 2 a 3 - Número de pratos teóricos - Distribuição do tempo de residência

23 Dimensionamento para Cromatografia convencional
Variáveis envolvidas: Número de colunas (Nco) Produção diária (Q) Capacidade da coluna por ciclo (Md) Número de ciclos por dia (Nci) Q Nco = Md . Nci

24 Considerando algumas situações limitantes do processo, pode-se chegar à expressão:
Q Nco = D2 . V . P Onde D é o diâmetro da coluna, V é a velocidade do fluido na saída e P é a concentração de proteína no eluído.