EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS EM

Apresentação em tema: "EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS EM"— Transcrição da apresentação:

1 EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS EM
BACTÉRIAS João Fernando Bortoleto Jeanne Blanco De Molfetta Machado

2 produção de proteínas heterólogas
Uso de uma célula ou um organismo para expressar uma proteína produzida em outra célula ou outro organismo. Ex.: TAQ DNA Polimerase, enzimas de restrição

3 Para que produzir proteínas recombinantes?
Pesquisa em estrutura e função de proteínas Imunização Fármacos: anticorpos terapêuticos, vacinas, hormônios, fatores de coagulação

4 Fator VIII da imunoglobulina recombinante
Insulina Interferon α

5 Por que expressar proteínas recombinantes?
Dificuldade de se purificar do tecido original Proteínas do tecido podem estar contaminadas Proteínas recombinantes podem ser engenheiradas Processo completamente controlado Especificidade Quantidade

6 Como preparar um sistema recombinante.
Isolar e preparar o DNA ou cDNA Escolher o sistema apropriado Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado Checar se a proteína foi expressa Checar se está solúvel Purificar Checar se está ativa Caracterizar a proteína

7 CLONAGEM E TRANSFORMAÇÃO EM PLASMÍDEOS
CLIVAGEM ou PCR LIGAÇÃO TRANSFORMAÇÃO

8 Como preparar um sistema recombinante
Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar Escolher o sistema apropriado Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado Checar se a proteína foi expressa Checar se está solúvel Purificar Checar se está ativa Caracterizar a proteína

9 Vetores de expressão- componentes básicos
Sítio de ligação do ribossomo Promotor M13 ORI- Sítio de poliadenilação malE Terminador Origem de replicação Marcadores seletivos

10 Características que devem ser avaliadas em cada sistema de expressão
Taxa de crescimento celular Complexidade do meio de cultura Custo do meio de cultura Nível de expressão Capacidade de expressar extracelularmente Capacidade de produzir as modificações pós-traducionais tais como: dobramento correto, formação das pontes dissulfeto, glicosilação, fosforilação, acetilação

11 Vantagens dos sistemas de expressão eucarióticos
Desvantagens dos sistemas de expressão eucarióticos - Dobramento das proteínas eucarióticas mais semelhante. - Níveis de expressão mais baixos. - Poucos vetores disponíveis - Adequado para proteínas ricas em cisteínas- pontes dissulfeto. - Sistemas caros - Modificações pós-traducionais. - Necessitam equipamentos adequados - Pode produzir grandes quantidades de proteínas com o uso de equipamentos próprios (fermentadores).

12 Escolha do sistema - hospedeiros
Bactérias Gram-negativas – E. coli e Caulobacter Bactérias Gram-positivas – Bacillus subtilis Leveduras – Saccharomyces pichiapastoris Fungos filamentosos – Aspergillus e Trichoderma Células de inseto Células de mamífero Células vegetais em cultura Oócito de Xenopus Plantas transgênicas e Animais transgênicos

13 Linhagens de E. coli modificadas - Gram negativa
EXPRESSÃO PROTEÍNA HETERÓLOGA Linhagens de E. coli modificadas - Gram negativa Replicação a cada 20 minutos em condições ideais de crescimento Disponibilidades de vários vetores de clonagem Disponibilidade de várias cepas mutantes, deficientes em proteases

14 Como preparar um sistema recombinante
Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar Escolher o sistema apropriado Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado Checar se a proteína foi expressa Checar se está solúvel Purificar Checar se está ativa Caracterizar a proteína

15 Eletroporação, biobalistica, vírus, ... X sistema

16 Como preparar um sistema recombinante
Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar Escolher o sistema apropriado Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado Checar se a proteína foi expressa Checar se está solúvel Purificar Checar se está ativa Caracterizar a proteína

17 Seleção Cepa Transformada
Vetores carregam gene resistência a antibióticos Manutenção Pressão Seletiva Meio + antibiótico

18 Seleção Antibióticos: ampicilina, canamicina, cloranfenicol, tetraciclina. Gentamicina Higromicina, canamicina Herbicidas: BASTA

19 Como preparar um sistema recombinante
Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar Escolher o sistema apropriado Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado Checar se a proteína foi expressa Checar se está solúvel Purificar Checar se está ativa Caracterizar a proteína

20 Tempo/ solubilidade Controle da indução S0 S3 C3 PM
PM S0 S1 S2 S3 S4 P0 P1 P2 P3 P4 S0 S3 C PM

21 Sistema procariótico Desvantagens
Não realiza modificações pós-traducionais - Não realiza secreção de proteínas. Algumas proteínas são tóxicas para as bactérias. Dobramento incorreto de proteínas (proteínas ricas em cys) -Tendência a formar corpúsculos de inclusão. Degradação proteolítica Codon usage (uso de tRNAs)

22  Alternativa sequenciar, uso do código
PROBLEMAS COMUNS da EXPRESSÃO em E. coli PROTEÍNA NÃO EXPRESSA  Alternativa sequenciar, uso do código

23 AGA, AGG, CGA, CGG,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Arg UGU, UGC Cys GGA, GGG Gly AUA Ile CUA, CUC Leu CCC, CCU, CCA Pro UCA, AGU, UCG, UCC Ser ACA Thr Presença de codons raros na proteína de interesse Codons raros em E.coli CÓDON PLUS, ROSETA

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25 Como preparar um sistema recombinante
Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar Escolher o sistema apropriado Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado Checar se a proteína foi expressa Checar se está solúvel Purificar Checar se está ativa Caracterizar a proteína

26 PURIFICAÇÃO PROTEÍNA RECOMBINANTE
pGEX – Glutationa S-Transferase agarose-glutationa pQE, pET – tag de Histidinas coluna de níquel Clivagem química ou enzimática

27 Sistemas de Purificação
Proteína de interesse GST Clivagem com fator Xa

28 clonagem Cromatografia lavagens eluição

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