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Produção de proteínas em bactérias Prof. Fabricio Rochedo Conceição 06 de abril de 2010 Graduação em Biotecnologia Disciplina.

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1 Produção de proteínas em bactérias Prof. Fabricio Rochedo Conceição 06 de abril de 2010 Graduação em Biotecnologia Disciplina de Biotecnologia Microbiana II

2 Proteína recombinante Proteína produzida a partir da expressão de uma molécula de DNA recombinante em um sistema de expressão adequado. DNA recombinante Molécula de DNA produzida a partir da combinação de seqüências de DNA provenientes de diferentes fontes.

3 Por que produzir e purificar proteínas recombinantes? Estudos bioquímicos Determinação da estrutura 3D Aplicações biotecnológicas - Terapia - Vacinas - Diagnóstico... Alternativa para as seguintes limitações: Quantidade Dificuldade de purificação a partir do tecido original Contaminação (príons, vírus, oncogenes...) Estabilidade: proteínas recombinantes podem ser engenheiradas Processo completamente controlado Alguns microrganismos não são cultiváveis in vitro ou são fastidiosos

4 Mycoplasma hyopneumoniae Pneumonia Micoplásmica Suína

5 Sistemas de expressão heteróloga ***Animais e plantas

6 Produção de proteínas recombinantes em bactérias Depois do Homo sapiens, a bactéria E. coli é o organismo mais estudado! Escherichia coliBacillus subtilis

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8 Engenharia genética X expressão heteróloga 1. Obtenção do DNA a ser clonado 2. Preparo do vetor 3. Ligação do vetor com o inserto 4. Transformação da bactéria 5. Seleção dos clones recombinantes

9 Necessitam de um promotor forte, de um RBS e de ATG Sítio de múltipla clonagem (polylinker) Promotores induzíveis (controle da expressão) Sinais de secreção Fusão com proteínas carreadoras (solubilidade e purificação) Vetores de Expressão

10 Vetor de expressão em E. coli RBS ou sequência de Shine Dalgarno

11 Regulação da expressão gênica – controle da expressão Operon Lac

12 Vetores da família pET (Novagen) Altos níveis de expressão Promotor T7 é mais forte que o lac Controle rigoroso pelo lacO Necessita de cepa de E. coli especial – BL21(DE3) IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)

13 Extrato total proteico de bactérias separado em SDS-PAGE não induzidas induzidas com IPTG Proteína recombinante de 70 kDa

14 Produção de proteínas recombinantes em bactérias (sistema pET)

15 Vetor de expressão com cauda de histidina

16 Cromatografia de afinidade – Ni-Sepharose -Purificação de proteínas com cauda de histidina (his-tag)

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18 -Minimizar a proteólise -Maximizar a expressão -Minimizar vazamento de expressão (importante para expressão de proteínas tóxicas) -Facilitar o folding -Solubilidade

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20 Algumas companhias que comercializam vetores de expressão

21 Primeiro hormônio recombinante disponível comercialmente para humanos; Antes de ser disponibilizada comercialmente era extraída de pâncreas de animais; Atualmente a forma recombinante é a mais usada no tratamento do diabetes. Produção de insulina recombinante (Humulin: Human insulin da Eli Lilley Corporation) Estrutura e biossíntese da molécula de insulina humana Cadeia α Cadeia β Ligações dissulfeto Seq sinal Peptídeo C Cadeia β Cadeia α Clivagem da sequência sinal de secreção Preproinsulina Proinsulina Clivagem do peptídeo C Insulina funcinal Peptídeo C Cadeia β Cadeia α

22 Obtenção de insulina recombinante

23 Algumas proteínas recombinantes disponíveis para terapia humana Insulina (rhI); Hormônio do crescimento (rhGH); Hormônio folículo estimulante (rhFSH); Fator VIII (rhFactorVIII); Eritropoetina (EPO); Fator estimulante de colônias de granulócitos (rhG-CSF); N-acetilgalactosamina-4-sulfatase (rhASB); DNAse Ativador do plasminogênio tecidual (rhTPA); Glicocerebrosidase (rhGBA); Interferon-alfa, -beta e gama (rhIFN-alpha, -beta e -gama); Fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1).

24 VantagensDesvantagens Genética e fisiologia bem conhecidasNão faz certas modificações pós-traducionais Enorme variedade de vetores disponíveisAtividade biológica pode diferir da proteína natural Fácil controle da expressão gênicaA bactéria apresenta alto conteúdo de endotoxinas Facilidade de manutenção em laboratórioFalta de um mecanismo de secreção Alta produção de proteínas heterólogasFormação de corpos de inclusão Vantagens e desvantagens do sistema de expressão heteróloga em E. coli

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26 * Formar grupos com 4 componentes * Buscar no PubMed artigo científico relacionado a expressão de proteína heteróloga em E. coli * Entregar até Referência bibliográfica - Descrição da proteína recombinante - Aplicação da proteína recombinante - Vetor utilizado para a expressão - Características do vetor de expressão - Estratégia de purificação da proteína recombinante - Resultados relacionados a expressão da proteína recombinante Trabalho complementar


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