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EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS EM BACTÉRIAS João Fernando Bortoleto Jeanne Blanco De Molfetta Machado.

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1 EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS EM BACTÉRIAS João Fernando Bortoleto Jeanne Blanco De Molfetta Machado

2 Uso de uma célula ou um organismo para expressar uma proteína produzida em outra célula ou outro organismo. Ex.: TAQ DNA Polimerase, enzimas de restrição produção de proteínas heterólogas

3 Para que produzir proteínas recombinantes? Pesquisa em estrutura e função de proteínas Imunização Fármacos: anticorpos terapêuticos, vacinas, hormônios, fatores de coagulação

4 Fator VIII da imunoglobulina recombinante Interferon α Insulina

5 Por que expressar proteínas recombinantes? Dificuldade de se purificar do tecido original Proteínas do tecido podem estar contaminadas Proteínas recombinantes podem ser engenheiradas Processo completamente controlado Especificidade Quantidade

6 Como preparar um sistema recombinante. Isolar e preparar o DNA ou cDNA Escolher o sistema apropriado Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado Checar se a proteína foi expressa Checar se está solúvel Purificar Checar se está ativa Caracterizar a proteína

7 CLONAGEM E TRANSFORMAÇÃO EM PLASMÍDEOS CLIVAGEM ou PCR TRANSFORMAÇÃO LIGAÇÃO

8 Como preparar um sistema recombinante Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar Escolher o sistema apropriado Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado Checar se a proteína foi expressa Checar se está solúvel Purificar Checar se está ativa Caracterizar a proteína

9 Vetores de expressão- componentes básicos malE M13 ORI- Marcadores seletivos Origem de replicação Promotor Sítio de poliadenilação Terminador Sítio de ligação do ribossomo

10 Características que devem ser avaliadas em cada sistema de expressão Taxa de crescimento celular Complexidade do meio de cultura Custo do meio de cultura Nível de expressão Capacidade de expressar extracelularmente Capacidade de produzir as modificações pós-traducionais tais como: dobramento correto, formação das pontes dissulfeto, glicosilação, fosforilação, acetilação

11 Vantagens dos sistemas de expressão eucarióticos - Dobramento das proteínas eucarióticas mais semelhante. - Modificações pós-traducionais. - Pode produzir grandes quantidades de proteínas com o uso de equipamentos próprios (fermentadores). Desvantagens dos sistemas de expressão eucarióticos - Sistemas caros - Necessitam equipamentos adequados - Poucos vetores disponíveis - Adequado para proteínas ricas em cisteínas- pontes dissulfeto. - Níveis de expressão mais baixos.

12 Escolha do sistema - hospedeiros Bactérias Gram-negativas – E. coli e Caulobacter Bactérias Gram-positivas – Bacillus subtilis Leveduras – Saccharomyces pichiapastoris Fungos filamentosos – Aspergillus e Trichoderma Células de inseto Células de mamífero Células vegetais em cultura Oócito de Xenopus Plantas transgênicas e Animais transgênicos

13 Replicação a cada 20 minutos em condições ideais de crescimento Disponibilidades de vários vetores de clonagem Disponibilidade de várias cepas mutantes, deficientes em proteases Linhagens de E. coli modificadas - Gram negativa EXPRESSÃO PROTEÍNA HETERÓLOGA

14 Como preparar um sistema recombinante Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar Escolher o sistema apropriado Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado Checar se a proteína foi expressa Checar se está solúvel Purificar Checar se está ativa Caracterizar a proteína

15 Eletroporação, biobalistica, vírus,... X sistema

16 Como preparar um sistema recombinante Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar Escolher o sistema apropriado Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado Checar se a proteína foi expressa Checar se está solúvel Purificar Checar se está ativa Caracterizar a proteína

17 Seleção Cepa Transformada Vetores carregam gene resistência a antibióticos Manutenção Pressão Seletiva Meio + antibiótico

18 Seleção Antibióticos: ampicilina, canamicina, cloranfenicol, tetraciclina. Gentamicina Higromicina, canamicina Herbicidas: BASTA

19 Como preparar um sistema recombinante Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar Escolher o sistema apropriado Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado Checar se a proteína foi expressa Checar se está solúvel Purificar Checar se está ativa Caracterizar a proteína

20 Tempo/ solubilidade Controle da indução PM S0 S1 S2 S3 S4 P0 P1 P2 P3 P4 S0 S3 C3 PM

21 Desvantagens Sistema procariótico Não realiza modificações pós-traducionais - Não realiza secreção de proteínas. Algumas proteínas são tóxicas para as bactérias. Dobramento incorreto de proteínas (proteínas ricas em cys) Codon usage (uso de tRNAs) -Tendência a formar corpúsculos de inclusão. Degradação proteolítica

22 PROBLEMAS COMUNS da EXPRESSÃO em E. coli PROTEÍNA NÃO EXPRESSA Alternativa sequenciar, uso do código

23 AGA, AGG, CGA, CGG,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Arg UGU, UGC Cys GGA, GGG Gly AUA Ile CUA, CUC Leu CCC, CCU, CCA Pro UCA, AGU, UCG, UCC Ser ACA Thr Presença de codons raros na proteína de interesse Codons raros em E.coli CÓDON PLUS, ROSETA

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25 Como preparar um sistema recombinante Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar Escolher o sistema apropriado Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado Checar se a proteína foi expressa Checar se está solúvel Purificar Checar se está ativa Caracterizar a proteína

26 PURIFICAÇÃO PROTEÍNA RECOMBINANTE pGEX – Glutationa S-Transferase agarose-glutationa pQE, pET – tag de Histidinas coluna de níquel Clivagem química ou enzimática

27 Proteína de interesse GST Clivagem com fator Xa Sistemas de Purificação

28 clonagem Cromatografia lavagenseluição

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