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Bactérias, leveduras e algas: biofábricas de proteínas Prof. Fabricio Rochedo Conceição 27 de março de 2012 Graduação em.

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1 Bactérias, leveduras e algas: biofábricas de proteínas Prof. Fabricio Rochedo Conceição 27 de março de 2012 Graduação em Biotecnologia Disciplina de Biotecnologia Microbiana II

2 Por que produzir e purificar proteínas recombinantes? Estudos bioquímicos Determinação da estrutura 3D Aplicações biotecnológicas - Terapia - Vacinas - Diagnóstico... Alternativa para as seguintes limitações: Quantidade Dificuldade de purificação a partir do tecido original Contaminação (príons, vírus, oncogenes...) Estabilidade: proteínas recombinantes podem ser engenheiradas Processo completamente controlado Alguns microrganismos não são cultiváveis in vitro ou são fastidiosos

3 Mycoplasma hyopneumoniae Pneumonia Micoplásmica Suína

4 Toxina botulínica Clostridium botulinum C e D Botulismo Como prevenir? Toxóide

5 Sistemas de expressão de proteínas heterólogas ***Algas, animais e plantas

6 2. Expression vectors 3. Hosts

7 Relação volume meio/capacidade do frasco 0,2 (20%) Inóculo – 5 a 10%

8 Bactérias e leveduras Microalgas Produção industrial

9 Algumas empresas que comercializam insumos para a expressão de proteínas heterólogas

10 Cultivo: - 28 a 37 C - Aerobiose - pH neutro - Fonte de C e N, microelementos (sais) Escherichia coliBacillus subtilis BACTÉRIAS

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13 APLICAÇÕES - Minimizar a proteólise - Maximizar a expressão - Minimizar vazamento de expressão (expressão de proteínas tóxicas) - Facilitar o folding - Solubilidade

14 VantagensDesvantagens Genética e fisiologia bem conhecidasNão faz certas modificações pós-traducionais Enorme variedade de vetores disponíveisAtividade biológica pode diferir da proteína natural Fácil controle da expressão gênicaA bactéria apresenta alto conteúdo de endotoxinas Facilidade de manutenção em laboratórioFalta de um mecanismo de secreção Alta produção de proteínas heterólogasFormação de corpos de inclusão Expressão heteróloga em E. coli

15 *** Alternativas

16 VantagensDesvantagens Não patogênico (sem LPS); GRASProteases extracelulares Codon usage adequadoPlasmídeos instáveis Possibilidade de secreção da proteínaExpressão geralmente menor que E. coli Biologia Molecular e Fisiologia conhecidas Alta produção de proteínas heterólogas Expressão heteróloga em B. subtilis *** Alternativas

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18 L EVEDURAS Eucariotos unicelulares – organelas Multiplicação rápida Manipulação simplificada Altas densidades celulares Não Patogênicas (GRAS) Fisiologia e genética bem conhecidas Realizam modificações pós-traducionais

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20 P RINCIPAIS ESPÉCIES UTILIZADAS Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris Pichia methanolica Hansenula polymorpha (Pichia augusta) Kluyveromyces lactis Schizosaccharomyces pombe Schwanniomyces occidentalis Yarrowia lipolytica

21 D ESVANTAGENS Saccharomyces cerevisiae Hiperglicosilação – mais de 100 resíduos de manose Alteração da antigenicidade da proteína Alteração da estrutura 3D Produção de etanol – tóxico Falha na secreção de proteínas Alternativa: outras espécies de leveduras

22 Pichia pastoris Metilotrófica – metanol como fonte única de carbono Glicosilação mais estável e semelhante a de mamíferos Fermentação pobre – não produz etanol e atinge altas densidades celulares 28 a 30 C, aerobiose, pH 5,0 - 6,0 Fonte de C (glicerol, metanol...) Fonte de N (sulfato de amônio)

23 Pichia pastoris Desvantagens Proteólise de proteínas secretadas Poucos vetores disponíveis (Invitrogen) Necessita o uso de fermentadores para atingir alta densidade celular – no entanto não realiza fermentação. Precisa de oxigênio!

24 M ETABOLISMO DO M ETANOL Álcool Oxidase Dois genes: AOX1 e AOX2 AOX1 é mais expresso e altamente induzido na presença de metanol Enzima tem baixa afinidade por metanol, formando formaldeído. Compensa produzindo grande quantidade de AOX (~30% do total de prot)

25 F ENÓTIPOS Mut = Metanol Utilization Mut + - crescimento rápido em metanol Mut S – crescimento lento em metanol

26 C EPAS

27 CLONAGEM - INTEGRAÇÃO

28 P ROTEÍNAS EXPRESSAS EM P ICHIA

29 MICROALGAS Eucariotos unicelulares que realizam fotossíntese Elaboração de alimentos e obtenção de compostos naturais de valor agregado Best of both worlds Microrganismos: rápido crescimento e facilidade de cultivo Plantas: capacidade de realizar modificações pós-transcripcionais/traducionais Rápida produção e scale up Meio de cultivo muito barato: sais, CO 2 e luz solar Não Patogênicas (GRAS) Baixo custo de produção de algumas proteínas recombinantes Chlamydomonas, Chlorella, Volvox, Haematococcus e Dunaliella Baixa expressão de proteínas heterólogas

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31 Chlamydomonas reinhardtii

32 Cultivo: - No geral 18 a 22 C - Agitação - Luz natural ou fluorescente - pH 8,2 – 8,7 - Microelementos (P, Zn, B...) - Salinidade 20 a 24 g.L -1

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