Avaliação da diversidade microbiana

Apresentação em tema: "Avaliação da diversidade microbiana"— Transcrição da apresentação:

1 Avaliação da diversidade microbiana
Amostragem, processamento e técnicas

2 Dificuldades na avaliação:
Falta de recursos humanos capacitados Falta de financiamento Amplitude da diversidade Erosão da diversidade Falta de metodologias Porquê avaliar? Assegurar que microrganismos desempenhem processos necessários a produtividade e sustentabilidade. Assegurar que pelo menos alguns microrganismos sejam tolerantes a estresses.

3 Detecção e avaliação – técnicas: i. Fenotípicas
Etapas da avaliação      Amostragem Processamento Detecção e avaliação – técnicas:          i.   Fenotípicas         ii.   Moleculares iii. Imunológicas

4 Amostragem Etapa crítica São usados equipamentos especializados
Devem ser considerados os seguintes fatores: - Representatividade - Não alterar os números e as atividades - Evitar a introdução de contaminantes - Estocar em condições adequadas

5 Problema da representatividade
Uso de amostras compostas para minimização do erro Determinação do número mínimo de amostras Estatística determinará os limites de confiança

6 Estratégias de amostragem
Ar é um meio restritivo para os microrganismos (1) Acesso - direto Amostragem no Número de microrganismos - Baixo Ar Equipamentos (1) Apesar de restritivo transmite inúmeros agentes patogênicos Processamento - Concentração em filtros

7 Microbiota do ar Morte dos microrganismos no ar:
dN/dt = -k.N ou ln (N/No) = -k.t k - coeficiente de inativação (velocidade específica de morte) Depende do tipo de microrganismo e das condições ambientais Fatores ambientais: Umidade relativa Temperatura Radiação (pigmentação, reparo do DNA) Radicais de O2 Íons, dentre outros

8 Os microrganismos alcançam o ar através dos aerossóis
Depende do tipo de microrganismo, partículas e fase gasosa

9 Amostragem do ar 1. Impacto - deposição em superfícies sólidas. Ex: coletor de Andersen 2.Simulação respiratória (tamanho partícula 0,8 – 15 μm; velocidade do ar) 3. Colisão - Captura em líquido. Ex: AG-30 4. Centrifugação 5. Filtração 6. Deposição - Coleta passiva

10 Amostrador de Andersen

11

12 Simulação respiratória

13 Placas após incubação Ágar Dextrose Ágar Sangue

14 Impacto em líquido: AG-30

15 Equipamentos para amostragem do ar:
Amostragem passiva Apenas microrganismos que caem nas placas Amostragem ativa Recuperação forçada usando um volume determinado

16 Método usado nas estações espaciais (Dados NASA)

17 Importância Aeromicrobiologia extramuro:
Dispersão de patógenos e toxinas (botulínica, estafilocócica, LPS) Fitopatógenos (ferrugem) Doenças pulmonares e gastro-intestinais de animais Despejo de resíduos (sólidos e líquidos) Guerra biológica Aeromicrobiologia intramuro: Edificios (doenças dos Legionários-Legionella pneumophila, bactéria aquática disseminada pelos aparelhos de ar condicionado e água potável) Viagens de avião Saúde pública - gripes

18 Depende nível de matéria orgânica
Acesso - Direto ou remoto Amostragem na Números - elevados ou baixos água Equipamentos -Recipientes, filtros Processamento - diluição ou concentração

19 Equipamentos ROV (Veículo operado de forma remota) usados nas águas hidrotermais (Yellowstone Park) Águas termais são difíceis de amostrar convencionalmente Mensageiro controlado remotamente abre o recipiente para não ocorrer contaminação com microrganismos de outras profundidades

20 Sedimentos Amostragem em Acesso - Remoto
Número de microrganismos - elevado Sedimentos Equipamentos - observatórios, sondas Processamento - diluição

21 Microbiota dos sedimentos
Um método efetivo de acesso ao sedimento enterrado é através de observatórios. Observatórios penetrando 300 m nos sedimentos e crostas Cowen, 2004

22 Baixa abundância (biomassa), porém microrganismos sempre presentes.
Ventarolas marinhas Baixa abundância (biomassa), porém microrganismos sempre presentes. Uso de sondas fluorescentes específicas para rRNA de Archaea e Bacteria e C radioativo para detectar atividade na crosta basáltica oceânica. Fisk et al., 1998

23 Sedimentos: Elevada diversidade de Bacteria e Archaea
180 reações metabólicas envolvendo N, S e C inorgânico, metais e minerais assim como compostos orgânicos Diversos micro-nichos existentes

24 Solo Acesso - direto Amostragem no
Números de microrganismos - elevado ou baixo Solo Equipamentos - trados, pás Processamento - diluição

25 SOLO Uma simples pá de solo de jardim contém mais espécies de organismos do que pode ser encontrado em toda a floresta Amazônica.

26 Problemas Heterogeneidade espacial solo 1-5 g solo
Distribuição dos microrganismos em agrupamentos Elevada variabilidade entre amostras Tradicionalmente 1-5 g solo Estatística Bactérias existem em “hot-spots” Dois fatores são críticos na escolha de um hot-spot: A existência de espécies endêmicas (restritas a um ecossistema específico )e grandes taxas de destruição do habitat.

27 Distribuição não homogênea
Solo propriamente dito Elevada população devido a riqueza nutricional da rizosfera. BIOMASSA /g Características: 1. Micro colônias (interação ativa dentro das populações) 2. Populações com elevadas velocidades crescimento 3. Modificações ambientais 4. Troca genética Elevada diversidade governada pela Lei do Mínimo de Liebig. Subsolo BIOMASSA - 107/g SOLO Distribuição não homogênea

28 Alguns números sobre a estrutura do solo

29 Maioria diversidade é desconhecida!
Microrganismos no solo Em cada grama solo tipicamente franco 2,8 X 105 m2 - dimensões continentais para microrganismos > 1X 1010 células viáveis > 4 X103 espécies << 0,1% são cultivadas in vitro Maioria dos grupos são conhecidos apenas por informações de sequenciamento de DNA Apenas 1 ou 2 membros cultivados pertencem a ordens conhecidas Maioria diversidade é desconhecida!

30 Números de microrganismos no solo:
Bactérias: 106 a 109/g solo Bacilos Gram % Bacilos Gram % Actinomicetos: % Arthrobacter, etc., 31-46% Algas: 101 x 106 g-1 Fungos: 104 a 106 g-1 Protozoários : 104 a 105 g-1 Bacteriófagos: ? % Culturabilidade por grupo: 0,8 a 7 %

31 Solo Macrofauna e flora são relativamente fáceis de identificar e expressar usando riqueza específica e outros índices. Mas no solo as estimativas da diversidade da microbiota: Envolvem dificuldades: heterogeneidade, grupos difíceis de cultivar em meio de cultura Estratégias FAME (ésteres metílicos de ácidos graxos) CHO (carboidratos) Técnicas moleculares usando PCR Sorologia

32 subsolo Amostragem no Populações - 107 /g
Importantes patogênicos para homem subsolo

33 Importância Cerca de 40 % água consumida pelo homem provem do fontes subterrâneas Existem gradientes nestas regiões: Forçado - quando água é movimentada em elevadas quantidades produzindo a movimentação dos microrganismos Passivo - natural sem influência artificial Doenças causadas aumentou 40 % nos últimos 10 anos Vírus, bactérias e protozoários tem diferentes dimensões, metabolismos, mecanismos de sobrevivência e mecanismos de transporte diferenciados. Estudo da diversidade da microbiota da subsuperficie é muito complexa.

34 Microbiota do subsolo Como vivem?
Pesquisada na última década (dificuldades de amostragem) Inúmeros aeróbios oligotróficos: /g Análise comunidades: Archaea e Bacteria (muitas BRS) Metanogênicas (CO2) CH4 Acetogênicas (HCO3-) acetato Bactérias redutoras de sulfatos (BRS) (SO4-2) sulfídrico H2 é gerado pelo FeO+H2O H2+FeO2 Como vivem? Quimioautotróficos e Quimiolitotróficos

35 Sedimentos profundos 1. Número de bactérias cultiváveis em sedimentos é de 1000 a x MENOR do que em solos superficiais.   2. Camadas areia-água apresentaram contagens e atividade mais elevadas, do que as camadas argilosas perto da superfície.  3. Profundidade não é necessariamente limitante ao crescimento e atividade. 4. Estudo enumerou coliformes, redutores de sulfato e metanogênicas: - Atividade anaeróbia medida pelo desaparecimento de lactato, formato e acetato e produção de metano e H2S. Sedimentos não incluem apenas anaeróbios, sendo inclusive de 100 a vezes menor do que os aeróbios.   - Número de coliformes baixou drasticamente com a profundidade, mas ainda estão presentes.

36 A 3,4 Km abaixo da superfície
Microbiota do subsolo Como sobrevivem? A 3,4 Km abaixo da superfície Possibilidades: 1. Foram incorporados nos sedimentos durante a formação das rochas há milhões de anos e sobrevivem em condições nutricionais de “dieta mínima”. 2. Infiltraram com as águas subterrâneas a partir de águas de superfície (maioria das bactérias que ocorrem em rochas como basalto e granito) 3. Crescem lentamente a partir de fontes de energia inorgânicas fornecendo carbono orgânico para outros microrganismos na matriz rochosa (SLiME - Subsurface Lithautotrophic Microbial Ecosystems).

37 Recentemente descobertos
Subsolo Recentemente descobertos 1-10 microrganismos /g de rocha (10-9 /g de solo superficial rizosférico) Densidade das comunidades é desconhecida: - Metabolismo microbiano é lento (dificuldade distinguir viável de inviável) - Células inviáveis são fonte nutricional para células viáveis (baixo movimento de água e nutrientes) - Difícil reproduzir as condições das profundezas em laboratório - Recentemente 9000 estirpes do subsolo foram catalogadas. - Peso dos microrganismos subterrâneos pode ser equivalente aos da superfície.

38 Biológicas Amostras Plantas - seiva, filosfera
Não destrutivas Plantas - seiva, filosfera Amostras Animais - sangue, dentes Biológicas Interação microrganismos - macrorganismos

39 Processamento Objetivo: recuperação ótima
Problemas: Porosidade dos filtros Composição quimica Concentração - centrifugação e passagem por filtros Microrganismos encontram-se em números inapropriados (elevados ou baixos) e em comunidades (diversas espécies) Enriquecimento Problemas: Composição do diluente Tempo de mistura Grau de agitação Diluição - diluições seriadas

40 Enriquecimento Desenvolvidas por Beijerinck
Para microrganismos que metabolizam uma determinada substância ou que ocorrem em baixas populações na amostra. Enriquecimento Desenvolvidas por Beijerinck Cultura de enriquecimento consiste na promoção de condições favoráveis específicas para o crescimento de um tipo particular de microrganismo. Ex 1: para isolar um fixador de nitrogênio o meio de enriquecimento não poderá conter uma fonte de nitrogênio. Ex 2: bactéria que degrada naftaleno deve-se cultivar a amostra em um meio cuja única fonte de C é o naftaleno. Ex 3: coluna de Winogradsky - enriquecimento de quimiolitotróficos. Ex 4: Para isolar Bacillus formadores de esporos aquecer a cultura mista e plaquear. Seleção natural aplicada in vitro

41 Detecção dos microrganismos
Métodos: Fenotípicos - baseadas no cultivo ou avaliação de certas propriedades do microrganismos Imunológicos - baseadas nas características imunológicas Moleculares - baseadas na constituição genotípica

42 Fenotípicos Métodos baratos e não requerem treinamento diferenciado
Amplificação de sinal: Cultivo em meio de cultura Técnicas morosas Em alguns sistemas não são precisas Isolamento  cultura pura  identificação

43 Plaqueamento Diluição seriada Amplificação sinal fenotípico colônias

44 Cultivo Crescer microrganismos em laboratório com base em características fenotípicas. Detectar grupos que usam determinada substância ou fonte energética e que vivem em determinadas condições físico-químicas. Ex: Geobacter metallireducens CH3COO Fe3+ + 4H2O  2HCO3- + 8Fe 2++ 9H+ Adicionar acetato como única fonte de C no meio de cultura permite a detecção de microrganismos que usam óxido de ferro como fonte de energia

45 Corantes vitais e fluorescência
Células vivas (verde) e mortas (vermelho) em uma cadeia de Streptococcus pyrogenes Corantes ácidos de núcleo: DAPI e verde SYTOX. Células danificadas exibem fluorescência verde. População mista de Micrococcus luteus e Bacillus cereus com células vivas (verde) e mortas . Corantes DAPI e vermelho Texas.

46 Técnica não envolve cultivo
Perfil lipídico - FAME Técnica não envolve cultivo O princípio se baseia no conceito de que alguns microrganismos possuem composições típicas de ácidos graxos celulares, os quais podem ser comparados à composição típica de ácidos graxos das cepas usadas para criar a biblioteca. Após comparação, a identificação dos microrganismos desconhecidos são determinadas.

47 Perfil FAME (Fatty acids methyl ester analysis)
Existe grande variabilidade no perfil da composição e proporção de ácidos graxos (membranas). Perfil FAME = impressão de uma espécie 2. Usado no estudo da diversidade microbiana em sistemas de tratamento de esgoto, em solos contaminados e biofilmes de sistemas de distribuição de água.

48 Requerem vastas livrarias
Outras técnicas fenotípicas Requerem vastas livrarias MARA - multiple antibiotic resistance activity ARA - antibiotic resistance analysis CSU - carbon source utilization Detecção de hospedeiros de vírus

49 Avaliação da abundância relativa
Enumeração Biomassa Atividade Contagem direta Contagem indireta

50 Contagem direta Lâmina Petroff-Hauser ao microscópio
Fluorescência, anticorpos Vantagens: Não requerem separação do microrganismo. Fornecem estimativas elevadas Desvantagens: Não distingue entre viáveis e não viáveis. Não permite análises subsequentes

51 Lâminas para contagem direta

52 Contagem indireta Contagem em placas NMP
Técnica de Diluição e plaqueamento

53 Diluições seriadas (resultado)

54 Enumeração NMP

55 NMP – número mais provável

56 Contagem indireta • Bioluminescência: detecta ATP residual
• Impedância/condutância: microrganismos alteram a corrente elétrica. Vantagens: - Detecção de viáveis - Seletividade (uso de meios específicos) Desvantagens: - permite a contagem de alguns tipos - Ausência de não cultiváveis

57 Avaliação da biomassa Parâmetro importante porque avalia os recursos energéticos disponíveis para a comunidade. Expresso em g e pode-se converter em energia: 4,9 Kcal/g peso seco Direta Filtração Centrifução Pesagem Indireta Proteína Peptideoglicano Quitina LPS DNA Dentre outros Baseia-se no fato de existir uma correlação direta entre a abundância de um microrganismo com alguma substância característica.

58 Avaliação da atividade
Fotossíntese – taxa de produção primária Respiração - consumo de O2 ou produção de CO2 Potencial heterotrófico - taxa de absorção de substâncias marcadas com radioisótopos Atividade enzimática - lacase, celulase, nitrogenase, amilase

59 Viáveis mas não cultiváveis (VNC) < 1% dos microrganismos podem ser cultivados no laboratório usando técnicas convencionais de cultivo. Os microrganismos que não são cultiváveis, mas são viáveis, se denominam VNC e requerem técnicas apropriadas para sua detecção. Ex: Fungos micorrízicos vesículo-arbusculares.