Ferritin and the response to oxidative stress Ferritin and the response to oxidative stress Orino, K. et al. (2001). Biochem. J. 357: 241-247 António A.

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1 Ferritin and the response to oxidative stress Ferritin and the response to oxidative stress Orino, K. et al. (2001). Biochem. J. 357: 241-247 António A. V. Pacheco 3º ano Bioquímica 2007/2008 Projecto Tutorial

2 Ferro Grupo Heme Hemoglobina Mioglobina Citocromos Transporte de O 2 Armazenamento de O 2 Respiração celular Grupo prostético de enzimas Rinonucleotídeo redutase NADH desidrogenase, succinato desidrogenase

3 Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + OH. + OH -  O aumento do ferro livre pode levar à formação de ROS (espécies reactivas de oxigénio) Reacção de Fenton Danos em Proteínas, Lípidos e ADN  (ROS)  stress oxidativo

4 Metabolismo do Ferro Captação Transporte Armazenamento Mobilização Tf – Transferrina; TfR - Receptor de transferrina; Heme OX – Heme Oxidase; DMT – Transportador de iões divalentes

5  A ferritina é uma proteína composta por 24 subunidades de 2 tipos (H e L), com peso molecular com cerca de 450 kDa e que pode conter até 4500 átomos de Fe (III).  É responsável pelo controlo do ferro a nível intracelular (reserva de ferro, fornecimento de ferro…) e encontra-se essencialmente no fígado.  Função de detoxificação e reserva de ferro  Homeostasia do ferro  A razão das subunidades H e L é variável.  Subunidade L: tem um papel importante na nucleação do ferro e na estabilidade da proteína  Subunidade H: tem uma forte actividade catalítica como ferroxidase, na oxidação do ferro ferroso.

6 Mecanismos de regulação (Torti e Torti, 2002)  Regulação transcricional  Regulação pós-transcricional independente do IRP, incluindo a estabilidade do RNAm e a estabilidade da proteína  Regulação traducional mediada por IRPs

7 Objectivo: Objectivo: Verificar o efeito do stress oxidativo na expressão da ferritina e qual o papel das subunidades H e L na resposta ao stress oxidativo em células HeLa.  Trabalhos anteriormente efectuados indicavam que:  Tratamento de células com agentes oxidantes Indução das subunidades L e H da Ferritina (Tsuji, T. et al., 2000)  Superexpressão da subunidade H Aumenta a resistência das células HeLa à toxicidade do H 2 O 2 (Cozzi, A. et al., 2000)

8  Efeito do H 2 O 2 na expressão da ferritina em células HeLa  Análise da expressão da ferritina na defesa contra o stress oxidativo  Superexpressão da Ferritina H e L em células HeLa Clonagem dos cDNAs da Ferritina H e L de rato em vectores de expressão Análise da expressão da ferritina Determinação dos níveis de RNAm Determinação dos níveis de proteína Efeito da expressão da Ferritina H e L (FH e FL) na formação de ROS

9 H 2 O 2 induz a expressão da ferritina em células HeLa Tratamento das células HeLa com H 2 O 2 : Aumento dos níveis de RNAm da ferritina H Aumento dos níveis de proteína da FH e da FL Northern-blot SDS-PAGE de proteínas imunoprecipitadas

10 Incubação Ensaio de retardação em gel dos IREs Incubação H 2 O 2 (125 µM) Isolamento de proteínas solúveis

11 RNA ligado à IRP RNA não degradado e não ligado RNA degradado IRP Activa IRP Total H 2 O 2 tem um efeito transitório na activação de IRPs em células HeLa Aumento da fracção do IRP activo/IRP total até às 4 h, diminuindo depois até aos valores basais Controlo positivo (agente quelante de ferro - activador do IRP) Tempo de incubação com H 2 O 2 ME – Mercaptoetanol D- Desferrioxamina

12 Transfecção de células HeLa com plasmídeo de expressão regulado pela Tc, contendo o cDNA de FH de rato Plaqueamento em meio sem Tetraciclina Análise do RNAm e proteína Aumento da expressão de Ferritina H nas células HeLa transfectadas Northern-Blot Imunoprecipitaçao e SDS-PAGE

13 Transfecção transitória de células com FH na presença e ausência de tetraciclina Tratamento das células com H 2 O 2 Efeito na Viabilidade RESULTADOS não concordantes Diferentes eficiências na transfecção Obtenção de uma população de células que expressasse uniformemente ferritina Objectivo:

14 P – Promotor; TetR – Repressor Tet; Da – Domínio de activação; tTa – Proteína transactivadora; Dox – Doxiciclina (análogo não tóxico da tetraciclina); Tet Op – Operador Tet _ _ _ _ _ _ _ _ Sistema de expressão genética induzida Tet-off

15 Utilização de células HeLa Tet-off que expressem de modo estável o transactivador tet, para a transfecção com vector de expressão, contendo a ferritina H e L, a jusante do operador tet. Síntese de ferritina é reprimida pela tetraciclina ou doxiciclina, mas induzida pela remoção de doxiciclina Imunoprecipitação + SDS-PAGE Ferritina HFerritina L Ferritina de Rato Ferritina Humana  H46 e H66 – Indução da síntese da ferritina H após remoção da doxiciclina  L6 e L46 - Indução da síntese da ferritina L após remoção da doxiciclina (+) adição de doxiciclina; (-) remoção de doxicilina

16 Expressão da ferritina H ou L diminui a produção de ROS em células tratadas com H 2 O 2 A super-expressão de Ferritina H ou L reduz, mas não evita a formação de ROS, por resposta à adição de agentes oxidantes H 2 DCF – DA (molécula não fluorescente lipossolúvel) H 2 DCF + ROS DCF Fluorescente Esterases intracelulares Ferritina L Ferritina H RFU – Relative Fluorescence Units

17  H 2 O 2 induz a expressão da ferritina H e L em células HeLa Ferritina é sujeita à regulação traducional Ligação dos IRPs a IREs  H 2 O 2 tem um efeito transitório na activação de IRPs na célula HeLa Síntese de ferritina aumentada apesar de uma activação inicial do IRP pelo H 2 O 2 Efeito do H 2 O 2 na expressão da ferritina em células HeLa H 2 O 2 induz a expressão da ferritina, independentemente da acção dos IRPs.

18 Conclusão / Discussão Análise da expressão da ferritina na defesa contra o stress oxidativo  Aumento da expressão de Ferritina nas células HeLa transfectadas Utilização de um sistema indutível ferritina em cultura de células HeLa crescidas na ausência de Tc Transfecção transitória resultados não reprodutíveis Utilização de células Tet-off para a expressão da ferritina  Superexpressão quer da FH quer da FL conduziu à diminuição dos níveis de ROS  Ambas as subunidades da ferritina contribuem para a defesa contra o stress oxidativo  A expressão da ferritina reduz mas não evita a formação de ROS

19 A ferritina é componente de uma resposta multifactorial anti-oxidante (e que envolve por exemplo os níveis de glutationa, SOD, catalase), com uma grande complexidade a nível de regulação transcricional e pós- transcricional.

20 António Pacheco