Universidade de São Paulo Escola de Engenharia de Lorena Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial Engenharia Bioquímica I Prof. Júlio César.

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1 Universidade de São Paulo Escola de Engenharia de Lorena Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial Engenharia Bioquímica I Prof. Júlio César dos Santos

2 Esterilização de equipamentos  Esterilização: eliminação de todas as formas de vida (O termo esterilização possui um significado absoluto e não relativo)  Dependendo do processo, não é desejável ou necessária (por exemplo, esterilização por calor danifica vitaminas)

3 Esterilização de equipamentos  Não é necessária em processos nos quais são produzidos inibidores microbianos (etanol, vinagre, ácido lático, etc.)  Em laticínios não é desejável esterilizar pois pode danificar os produtos. É feita só uma redução da carga contaminante por pasteurização.

4 Esterilização de equipamentos  Indústria de alimentos: não necessariamente é feita a esterilização. Mantém-se a população restante sob controle por refrigeração, congelamento, uso de sal / açúcar, conservantes, biocidas, bioestáticos  Processo destinado a saúde humana e enlatados: esterilização rigorosa

5 Esterilização de equipamentos  Métodos físicos e químicos  Reatores: calor úmido  Equipamentos para processamento de produtos de fermentação : calor úmido ou agentes químicos  Material de laboratório: calor úmido / calor seco (mais raramente por radiação UV)

6 Esterilização de equipamentos  Meios de fermentação : calor úmido (se não for possível, filtração por membranas ou cartuchos)  Ar: cartuchos  Os métodos de esterilização agem destruindo estruturas microbianas (paredes celulares, ácidos nucléicos) ou inativando enzimas e proteínas, ou ainda induzindo a formação de substâncias letais no interior das células.  O número de micro-organismos que sobrevive a um processo depende da população inicial presente (importância da limpeza)

7 Esterilização de equipamentos  Modo de ação  Calor úmido  Desnaturação irreversível das proteínas microbianas  A resistência das proteínas ao calor é função da hidratação da célula (quanto mais água, maior o poder de destruição)  Vapor de água entra nos domínios internos das proteínas, causando mudanças irreversíveis

8 Esterilização de equipamentos  Modo de ação  Calor úmido  Carboidratos também sofrem alteração : caramelizam e geram produtos tóxicos  - Vapor sob pressão (autoclaves): transferência de calor (favorecida pela condensação, levando a um rápido aumento na temperatura); nível de hidratação das células

9 Esterilização de equipamentos  Modo de ação  Calor seco  Oxidação das constituintes celulares (dependendo do conteúdo de água na célula, pode ocorrer também a coagulação de proteínas)  Transferência de calor mais lenta e menor nível de hidratação

10 Esterilização de equipamentos  Modo de ação  Calor seco  Menos eficiente : ao contrário do calor úmido, nesse tipo de esterilização o calor é transferido muito lentamente e o nível de hidratação das células tende a diminuir, conferindo urna certa proteção às proteínas.  Organismo de controle da eficiência do método (calor): Bacillus stearothermophilus

11 Esterilização de equipamentos  Modo de ação  UV  Absorvida por ácidos nucléicos, onde causa lesões  Região abiótica : 220-300nm (253,7nm é o λ mais eficaz)  Purinas e pirimidinas: 260nm (gera ligações que causam mutações, impedem a replicação do DNA)

12 Esterilização de equipamentos  Modo de ação  UV  Aminoácidos aromáticos: 280nm  Nos ácidos nucléicos, as pirimidinas são mais sensíveis  Ligações cruzadas entre pirimidinas adjacentes (geram dímeros)

13 Esterilização de equipamentos  Modo de ação  UV  Há mecanismos de reparo do DNA, dependendo do nível da lesão  Vários fatores podem influenciar na sensibilidade microbiana a UV. Destacam-se o pH e o estado fisiológico das células (a maior atividade é na fase logarítmica de crescimento), constituição genética

14 Esterilização de equipamentos  Modo de ação  Radiação ionizante  Raios α, β, γ,x, prótons, elétrons, nêutrons  Perda de viabilidade por dano ao DNA  Sob radiação ionizante, um átomo emite elétrons de elevada energia, ionizando sua molécula. Este elétron é absorvido por outro átomo (processo em cadeia)

15 Esterilização de equipamentos  Modo de ação  Radiação ionizante  Geram-se radicais químicos altamente reativos, os quais podem alterar grupamentos químicos em moléculas importantes para as células, podendo ainda “quebrar” as fitas de DNA

16 Esterilização de equipamentos  Modo de ação  Radiação ionizante  Geralmente, a sensibilidade dos diferentes organismos a radiações ionizantes varia com o volume de DNA. Em geral, formas multicelulares são mais sensíveis à radiação ionizante que organismos unicelulares

17 Esterilização de equipamentos  Modo de ação  Óxido de etileno  É um gás inflamável, corrosivo, explosivo e carcinogênico (bem penetrante)  Éster cíclico : mata por ser agente alquilante  Alquilação de proteínas, ácidos nucléicos e outras moléculas (substituição de um átomo de hidrogênio pela molécula de EtO aberta)

18 Esterilização de equipamentos  Modo de ação  Óxido de etileno

19 Esterilização de equipamentos  Modo de ação  Óxido de etileno  É usado em mistura com CO 2 e hidrofluorocarbonetos, o que reduz o risco de incêndios e explosão  A eficácia depende de fatores como concentração, temperatura, umidade e tempo de exposição

20 Esterilização de equipamentos  Modo de ação  Óxido de etileno  Tira-se todo o ar da câmara e injeta-se óxido de etileno. Exposição por 6h. Depois, retira-se todo o óxido de etileno antes de abrir a câmara novamente.  Organismo de controle da eficiência do método: Bacillus atrophaeus

21 Esterilização de equipamentos  Modo de ação  Glutaraldeído  Age na superfície das células  Reage com aminas livres de peptideoglicano de bactérias, o que interfere no transporte de aminoácidos de baixo peso molecular  Pode fazer ligações cruzadas entre as células (aglutinação celular)

22 Esterilização de equipamentos  Esterilização por agentes físicos  Calor úmido  Uso mais frequente  Fácil obtenção, manuseio, eficácia e com custo relativamente baixo  Vapor é produzido em caldeiras e distribuído por dutos de aço galvanizado ou inox, isolados termicamente

23 Esterilização de equipamentos  Esterilização por agentes físicos  Calor úmido  Pelas altas temperaturas e pressões nas caldeiras, o vapor é considerado estéril.  No entanto, em alguns casos mais críticos, utiliza-se filtração em cartuchos esterilizantes imediatamente antes da entrada do vapor no processo.

24 Esterilização de equipamentos  Esterilização por agentes físicos  Calor úmido: reatores vazios  Injeta-se vapor para expulsar o ar (para evitar a formação de bolsões de ar)  Fecha-se o sistema e injeta-se vapor até a temperatura e pressão adequadas

25 Esterilização de equipamentos  Esterilização por agentes físicos  Calor úmido: reatores vazios  Espera-se o tempo necessário  Injeta-se ar esterilizado (para expulsar o vapor impedindo que gere vácuo, o que poderia causar danos ao reator ou promover a entrada de ar externo não-esterilizado através de fissuras, fendas, etc.)  Carrega-se o meio

26 Esterilização de equipamentos  Esterilização por agentes físicos  Calor úmido: reatores com meio  Descontínua, feita em 3 etapas  Deve-se agitar o meio  (1) Injeta-se vapor (96-97 °C) na serpentina ou camisa  Necessária a relação adequada entre volume e a área de troca de calor

27 Esterilização de equipamentos  Esterilização por agentes físicos  Calor úmido: reatores com meio  (2) Injeta-se vapor vivo até 100 °C  Fecha-se o sistema até atingir a pressão e temperatura desejadas  (3) A injeção direta de vapor é cortada e controla-se a pressão e temperatura pela serpentina ou camisa

28 Esterilização de equipamentos  Esterilização por agentes físicos  Calor úmido: reatores com meio  O tempo depende das condições do reator/processo (Ex.: Se for um reator multipropósito, utilizado com bactérias ou fungos formadores de esporos altamente resistentes ao calor, ele deve passar por assepsia química antes da esterilização por vapor e a esterilização por vapor deve ser mais longa)

29 Esterilização de equipamentos  Esterilização por agentes físicos  Calor úmido: reatores com meio  Pode ser automatizada  A injeção direta de vapor provoca um aumento no volume de meio de cultura de cerca de 10 a 15%, em função da condensação. Por essa razão, o meio de cultura deve ser preparado concentrado, tendo em vista sua posterior diluição pelo condensado.

30 Esterilização de equipamentos  Esterilização por agentes físicos  Calor úmido: reatores com meio  Reatores de pequeno porte, vidrarias, meios de cultura  O aquecimento para geração de vapor pode ser elétrico ou a gás  Nas autoclaves verticais a porta de acesso localiza-se na parte superior. As horizontais podem ter uma ou duas portas de acesso.

31 Esterilização de equipamentos  Esterilização por agentes físicos  Calor úmido: reatores com meio  Vapor pode ser gerado internamente ou em uma caldeira e injetado na autoclave  A esterilização em autoclave não altera significativamente o volume dos líquidos presentes nos frascos ou reatores.

32 Esterilização de equipamentos  Esterilização por agentes físicos  Calor seco  Aplicada a vidrarias, metais e sólidos resistentes ao calor  Menos eficiente que o calor úmido, por isso usa-se maior temperatura e mais tempo  Utilizada para materiais que não podem entrar em contato com umidade (podem oxidar)

33 Esterilização de equipamentos  Esterilização por agentes físicos  Calor seco  Geralmente acima de 150°C  Tempos podem chegar a 3-4h  UV  Aplicada a materiais sólidos como vidrarias, utensílios metálicos, embalagens, etc.

34 Esterilização de equipamentos  Esterilização por agentes físicos  UV  Não deve ser usada na presença de pessoas ou animais  Deve-se controlar a vida útil das lâmpadas (a emissão diminui com o tempo)  Baixa penetração: apenas superficial (método auxiliar; demora várias horas)

35 Esterilização de equipamentos  Esterilização por agentes físicos  Radiação Gama  Produzida por cobalto 60 ou césio 137  Alto poder de penetração  Não resulta em radiação residual (método seguro)

36 Esterilização de equipamentos  Esterilização por agentes físicos  Radiação Gama  O bombardeio de microrganismos por gama altera as moléculas de DNA, danificando-as - em geral irreversivelmente. Adicionalmente, inúmeras moléculas internas aos microrganismos são ionizadas (a água, por exemplo), dando origem a espécies tóxicas altamente reativas, como os peróxidos e vários radicais livres.

37 Esterilização de equipamentos  Esterilização por agentes físicos  Radiação Gama  Essas moléculas desestruturam o equilíbrio bioquímico dos microrganismos, mesmo esporulados.  Feita em câmaras especiais, em geral grandes  Operação contínua (emissão espontânea)

38 Esterilização de equipamentos  Esterilização por agentes físicos  Radiação Gama  Material circula sobre esteiras em containers  Aplicada a vidrarias, metais, material sólido (pó, solo, sementes, embalagens, etc)  Unidade de medida é o Gray (1 gray = 100 rad)  Micro-organismo mais resistente: Deinococcus radiodurans - 60 quilograys

39 Esterilização de equipamentos  Esterilização e desinfecção por agentes químicos  Método usado em equipamentos ou componentes nos quais não se pode empregar vapor úmido devido a incompatibilidade dos materiais de construção desses componentes com temperaturas elevadas  Filtros, bombas, centrífugas, válvulas, linhas de transferência de fluidos, equipamentos de medição

40 Esterilização de equipamentos  Esterilização e desinfecção por agentes químicos  Germicidas químicos  Em geral líquidos  Agem em temperatura ambiente  Requerem maior tempo de contato

41 Esterilização de equipamentos  Esterilização e desinfecção por agentes químicos  Germicidas químicos  Capacidade ligada à propriedades do material (material plástico ou metálico, superfície lisa ou rugosa, porosidade do material, ausência ou presença de locais de difícil acesso) e as características ambientais (pH, presença de matéria orgânica, formação de filmes, dureza da água, presença de sabão)

42 Esterilização de equipamentos  Esterilização e desinfecção por agentes químicos  Germicidas químicos  Há muito desenvolvimento devido a problemas de infecção hospitalar

43 Esterilização de equipamentos  Esterilização e desinfecção por agentes químicos  Nível de resistência dos microorganismos: página 32-34  1. Bactéria Esporulante: alto  Bacillus subutilis, Clostridium sporogenes  2. Micobactérias : alto a intermediário  Mycobacterium tuberculosis var. bovis

44 Esterilização de equipamentos  Esterilização e desinfecção por agentes químicos  Nível de resistência dos micro-organismos: página 32-34  3. Vírus pequenos ou não lipídicos : alto a intermediário  Poliovírus, rhinovírus  4. Fungos : intermediário a baixo  Trichophyton spp., Cryptococcus spp., Candida spp.

45 Esterilização de equipamentos  Esterilização e desinfecção por agentes químicos  Nível de resistência dos micro-organismos: página 32-34  5. Bactéria vegetativa : baixo  Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella choleraesuis  6. Vírus médios ou lipídicos : baixo  Vírus da herpes simplex, Citomegalovírus

46 Esterilização de equipamentos  Esterilização e desinfecção por agentes químicos  Germicidas de alto nível  a) Germicidas de nível alto (para esporos bacterianos)  Soluções aquosas de glutaraldeído, peróxido de hidrogênio 6-30% e produtos contendo ácido peroxiacético e H 2 O 2 (0,1% e 1% v/v, respectivamente)

47 Esterilização de equipamentos  Esterilização e desinfecção por agentes químicos  Germicidas de alto nível  a) Germicidas de nível alto (para esporos bacterianos)  ClO 2 : fortemente oxidante e corrosivo (uso limitado em superfícies de metal ou plástico)  Formaldeído em solução : efetivo, porém carcinogênico

48 Esterilização de equipamentos  Esterilização e desinfecção por agentes químicos  b) Germicidas de nível intermediário  Devem inativar Mycobacterium tuberculosis var. bovis, fungos, vírus lipídicos ou não lipídicos e bactérias vegetativas (porém não necessariamente esporos bacterianos)  Etanol ou Isopropanol nas porcentagens de 70-90%  Compostos clorados 500-5000 ppm de cloro livre

49 Esterilização de equipamentos  Esterilização e desinfecção por agentes químicos  b) Germicidas de nível intermediário  Solução aquosa de H 2 O 2 3-6%  Preparações fenólicas

50 Esterilização de equipamentos  Esterilização e desinfecção por agentes químicos  c) Germicidas de nível baixo  São capazes de destruir formas vegetativas de bactérias, a maioria dos fungos e vírus que contém lipídeos em sua composição  Compostos quaternários de amônio 0,1 a 0,2 %

51 Esterilização de equipamentos  Esterilização e desinfecção por agentes químicos  Para desinfeção / esterilização do equipamento  A) desmontagem do equipamento (se for o caso)  B) limpeza dos componentes (usar detergente, se for o caso)  C) lavagem com água de baixa dureza (para remoção de detergentes)  D) montagem do equipamento e introdução da solução germicida (pelo tempo necessário)

52 Esterilização de equipamentos  Esterilização e desinfecção por agentes químicos  Para desinfeção / esterilização do equipamento  E) drenagem da solução germicida  F) remoção de germicidas com água ou outro fluido estéril  Tempo de exposição varia com o nível de sanitização desejado, o tipo de germicida e as características da população microbiana (tipo e número) que se pretende destruir

53 Esterilização de equipamentos  Esterilização e desinfecção por agentes químicos  Agentes gasosos  Normalmente não empregados em indústria de fermentação para esterilizar equipamentos  Assepsia de salas e laboratórios : vapores de formaldeído  Óxido de etileno : esterilização dos mais diversos itens hospitalares, artigos plásticos de laboratório e outros materiais

54 Esterilização de equipamentos  Esterilização e desinfecção por agentes químicos  Agentes gasosos  Óxido de propileno : esterilização de alimentos  Formaldeído ou betapropiolactona : desinfeção de câmaras, solos e ambientes  Resistência dos microrganismos depende do agente usado, da concentração deste, da umidade relativa e da temperatura do processo