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Utilização de Polimorfismos em Análises Forenses Emmanuella Rodrigues.

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Apresentação em tema: "Utilização de Polimorfismos em Análises Forenses Emmanuella Rodrigues."— Transcrição da apresentação:

1 Utilização de Polimorfismos em Análises Forenses Emmanuella Rodrigues

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3 Relembrando... Polimorfismo Genético É a coexistência de alelos múltiplos em um lócus cromossômico; regiões do genoma nas quais existem variações entre as pessoas. Polimorfismo Genético É a coexistência de alelos múltiplos em um lócus cromossômico; regiões do genoma nas quais existem variações entre as pessoas. Polimorfismo de sítio de restrição (RFLP) Polimorfismo de sítio de restrição (RFLP) Polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) Polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) Polimorfismos de inserção/deleção (indels) Polimorfismos de inserção/deleção (indels) Polimorfismos de minissatélites (VNTR) Polimorfismos de minissatélites (VNTR) Polimorfismos de microssatélites (STR) Polimorfismos de microssatélites (STR)

4 Qual a importância desses polimorfismos? Fonte de variabilidade; Permitem construir um perfil genético indivíduo-específco DNA fingerprint; importante em Medicina Forense

5 Por que analisar tais polimorfismos no DNA? Determinação de paternidade; Determinação de paternidade; Resolução de casos criminais envolvendo: Resolução de casos criminais envolvendo: Estupro; Estupro; Homicídio; Homicídio; Rapto; Rapto; Troca ou abandono de crianças. Troca ou abandono de crianças.

6 De onde pode ser extraído o DNA? Sangue padrão-ouro; Sangue padrão-ouro; células epiteliais da mucosa oral: saliva, pontas de cigarro, selos e envelopes, gomas de mascar, copos, tampas de caneta mordidas,...; células epiteliais da mucosa oral: saliva, pontas de cigarro, selos e envelopes, gomas de mascar, copos, tampas de caneta mordidas,...; Pêlos e fios de cabelo (com ou sem o bulbo capilar); Pêlos e fios de cabelo (com ou sem o bulbo capilar); Unhas; Unhas; Esfregaços; Esfregaços;

7 De onde pode ser extraído o DNA? Manchas de material biológico: líquido seminal, urina, saliva, sangue; Manchas de material biológico: líquido seminal, urina, saliva, sangue; Tecidos de biópsias cirúrgicas; Tecidos de biópsias cirúrgicas; Ossadas (carbonizadas ou não); Ossadas (carbonizadas ou não); Tecidos mumificados ou congelados; Tecidos mumificados ou congelados; Células deixadas por impressão digital; Células deixadas por impressão digital; Dentes; Dentes; outras outras

8 Como extrair o DNA? Técnicas específicas para cada tipo de amostra; Técnicas específicas para cada tipo de amostra; CUIDADO: O sucesso da tipagem de DNA depende basicamente da qualidade e quantidade de DNA extraído CUIDADO: O sucesso da tipagem de DNA depende basicamente da qualidade e quantidade de DNA extraído

9 Métodos disponíveis para utilização: VNTRs estudados com sondas multilocais; VNTRs estudados com sondas multilocais; STRs estudados com PCR; STRs estudados com PCR; DNA mitocondrial (mtDNA); DNA mitocondrial (mtDNA); STRs do Cromossomo Y; STRs do Cromossomo Y; Técnicas mais recentes. Técnicas mais recentes.

10 VNTRs estudados com sondas multilocais Princípio do método: após clivagem por endonucleases, cada indivíduo tem um padrão de bandas específico com tamanhos determinados pela presença, ou não, do sítio da enzima e pela quantidade de repetições em tandem. Para que possa-se visualizar, esses fragmentos devem ser hibridizados a sondas radioativas de seqüência invariável. Princípio do método: após clivagem por endonucleases, cada indivíduo tem um padrão de bandas específico com tamanhos determinados pela presença, ou não, do sítio da enzima e pela quantidade de repetições em tandem. Para que possa-se visualizar, esses fragmentos devem ser hibridizados a sondas radioativas de seqüência invariável.

11 VNTRs estudados com sondas multilocais

12 Técnica de custo razoável; Técnica de custo razoável; DNA não degradado; DNA não degradado; Quantidade suficiente de DNA; Quantidade suficiente de DNA; Várias dificuldades inerentes à técnica. Várias dificuldades inerentes à técnica. VNTRs estudados com sondas multilocais

13 Teste de paternidade: Teste de paternidade: VNTRs estudados com sondas multilocais

14 Identificação de um criminoso: Identificação de um criminoso:

15 STRs estudados com PCR Princípio do método: Reação de PCR utilizada para copiar extensivamente várias regiões de STR, fornecendo fragmentos de tamanhos diferentes visualizados por eletroforese em gel de poliacrilamida ou por seqüenciamento Princípio do método: Reação de PCR utilizada para copiar extensivamente várias regiões de STR, fornecendo fragmentos de tamanhos diferentes visualizados por eletroforese em gel de poliacrilamida ou por seqüenciamento

16 STRs estudados com PCR

17 Recuperação de DNA em amostras de tecidos e fluidos Amostra (tecidos e fluidos) Quantidade recuperada Análise de RFLP Análise de STR 1mL de sangue 20 a 40 g SIMSIM Manchas de sangue seco de 1cm 3 200ngNÃOSIM Sêmen 150 a 300 g por mL SIMSIM Sêmen (esfregaço vaginal pós-coito) 0 a 3 g (DNA dos espermatozóides) SIMSIM Cabelo com raiz (contendo bulbo capilar) 1 a 750ng por fio NÃOSIM Saliva 1 a 10 gpor mL SIMSIM Retirado de Os exames de DNA nos Tribunais, Revista Ciência Hoje (vol. 29, nº março/2001)

18 Vantagem sobre a técnica de VNTR: como o DNA é amplificado, a amostra a ser analisada pode ter uma quantidade inicial muito menor. Vantagem sobre a técnica de VNTR: como o DNA é amplificado, a amostra a ser analisada pode ter uma quantidade inicial muito menor. Mesmo existindo contaminação por DNA de outras espécies, a técnica de PCR é específica o suficiente para amplificar apenas o DNA humano Mesmo existindo contaminação por DNA de outras espécies, a técnica de PCR é específica o suficiente para amplificar apenas o DNA humano STRs estudados com PCR

19 OBS: Quantas regiões são necessárias? OBS: Quantas regiões são necessárias?

20 mtDNA Características importantes: Características importantes: Também contém regiões polimórficas que permitem a individualização; Também contém regiões polimórficas que permitem a individualização; Descendentes recebem apenas da mãe permite traçar a linhagem materna de uma pessoa; Descendentes recebem apenas da mãe permite traçar a linhagem materna de uma pessoa; É mais resistente à degradação que o DNA nuclear. É mais resistente à degradação que o DNA nuclear. taxa mutacional do mtDNA é 5-10 vezes maior que a do DNA nuclear poucos mecanismos de reparo permitem que as variações nos nucleotídeos sejam acumuladas taxa mutacional do mtDNA é 5-10 vezes maior que a do DNA nuclear poucos mecanismos de reparo permitem que as variações nos nucleotídeos sejam acumuladas

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22 Princípio do método: Reação de PCR com o objetivo de copiar extensivamente regiões polimórficas presentes no DNA mitocondrial, analisado posteriormente por sequenciamento Princípio do método: Reação de PCR com o objetivo de copiar extensivamente regiões polimórficas presentes no DNA mitocondrial, analisado posteriormente por sequenciamento mtDNA

23 mtDNA

24 Utilizado quando a amostra em questão tem uma quantidade pequena ou não tem DNA nuclear; Utilizado quando a amostra em questão tem uma quantidade pequena ou não tem DNA nuclear; mtDNA

25 Utilizado na identificação de corpos em grandes desastres comparar a seqüência de interesse com a obtida nos possíveis irmãos ou ascendentes maternos; Utilizado na identificação de corpos em grandes desastres comparar a seqüência de interesse com a obtida nos possíveis irmãos ou ascendentes maternos; Identificação de maternidade sem o pai (p/ filhos e filhas) Identificação de maternidade sem o pai (p/ filhos e filhas) Não identifica um indivíduo específico; Não identifica um indivíduo específico; Estudos históricos ou evolutivos. Estudos históricos ou evolutivos. mtDNA

26 STRs crY Características importantes: Características importantes: Também contém regiões polimórficas que permitem a individualização; Também contém regiões polimórficas que permitem a individualização; Homens recebem apenas do pai permite traçar a linhagem paterna de um homem; Homens recebem apenas do pai permite traçar a linhagem paterna de um homem; Crossing-over com o crX em regiões homólogas entre os 2 cromossomos. Crossing-over com o crX em regiões homólogas entre os 2 cromossomos.

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28 STRs crY

29 Identificação de paternidade sem o pai (p/ filhos); Identificação de paternidade sem o pai (p/ filhos); Elucidação de estupro (mistura de DNA); Elucidação de estupro (mistura de DNA); Não identifica um indivíduo específico; Não identifica um indivíduo específico; Estudos históricos ou evolutivos; Estudos históricos ou evolutivos;

30 Técnicas mais recentes SNPs SNPs Minisseqüenciamento; Minisseqüenciamento; São muito numerosos; São muito numerosos; Baixa taxa de mutação; Baixa taxa de mutação; Requer maior nº de marcadores; Requer maior nº de marcadores; Indels Indels Estudados em produtos de amplificação muito curtos (50pb ou menos) vantagem sobre STRs em estudos de DNA extremamente degradado (ex: cadáver em estado avançado de decomposição ou carbonizado)

31 E no futuro... Bancos completos de perfil de criminosos OBS: Bancos completos de perfil de criminosos OBS: Inglaterra Inglaterra CODIS – Combined DNA Index System (1994) CODIS – Combined DNA Index System (1994) Amostra de DNA retrato falado Amostra de DNA retrato falado


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