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E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM PROCARIOTO E EUCARIOTO Amanda Focosi Sarmento Ana Cláudia Gabriela Alexandre de Santis Nathani Cristina Baccarim.

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1 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM PROCARIOTO E EUCARIOTO Amanda Focosi Sarmento Ana Cláudia Gabriela Alexandre de Santis Nathani Cristina Baccarim Denardi

2 INTRODUÇÃO O que são proteínas heterólogas? uma proteína é experimentalmente colocada em uma célula que normalmente não expressa a proteína importante quando se pretende proceder ao estudo funcional das mesmas utilização de microrganismos geneticamente modificados, capazes de sintetizar proteínas em grande quantidade, apresenta, sob o ponto de vista econômico, uma vantagem considerável em relação aos processos clássicos de produção diferentes sistemas de expressão: procariotos e eucariotos

3 Importância das proteínas: essenciais à estrutura, à função, e ao regulamento celular responsáveis pela homeostasia do organismo inúmeras finalidades: diagnóstica, terapêutica e de prevenção (vacinas)

4 R ELEMBRANDO... Tecnologia de DNA recombinante obter e combinar genes de uma variedade de fontes O DNA recombinante pode servir para produzir proteínas de valor comercial

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6 Clonagem gênica isolamento amplificação purificação de um gene ou de genes, a partir do material genético de um dado organismo Vetores veículos de clonagem que permitem que os fragmentos de DNA a serem clonados sejam introduzidos e propagados em uma célula hospedeira adequada. Célula hospedeira células de fácil manipulação, crescimento rápido e constituição genética bem conhecida

7 S ISTEMAS DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES PROCARIOTO E. coli EUCARIOTO Leveduras baculovírus/células de inseto cultura de células de mamíferos células de plantas

8 Escolher o Vetor Preparar o Inserto Preparar o Vetor Clonar o Inserto no vetor Transformação em célula de expressão

9 V ETORES Subclonagem em plasmideos de expressão: O procedimento de clonagem de um fragmento de DNA para expressão é exatamente igual a qualquer clonagem propósito será obter a proteína correta respeitar o sinal de tradução de genes procarióticos (o DNA deve ser clonado de maneira que sua fase de leitura correta fique em fase com o ATG iniciador)

10 CLONAGEM EM E. COLI Vantagens: Vantagens: Vasto conhecimento da genética e fisiologia de E. coli Diversidade de vetores de clonagem Fácil controle da expressão genica Fácil crescimento com elevadas produções Secreção do produto no meio de cultura

11 Desvantagens: Desvantagens: Não realiza modificações pós-traducionais capacidade limitada de formar pontes dissulfídricas atividade biológica e imunogenicidade podem diferir da proteína natural elevado conteúdo de endotoxinas

12 Vetor para expressão em E. coli: origem de replicação marcador para seleção: gene que confere resistência a antibióticos (Ex. o gene da - lactamase > resistência a ampicilina) promotor para transcrição: Componente crítico do vetor de expressão Controla o primeiro estágio de expressão gênica, a ligação do RNA polimerase ao DNA; Determina a frequência na qual o mRNA é sintetizado. Possibilidade de regulação do promotor (Indução e Repressão) regulável, isto é, contendo um repressor para manter os níveís basais de expressão do gene insignificantes até a indução, o que se faz geralmente por adição de IPTG, no caso por ex. do repressor lacI, ou choque térmico, no caso do repressor cIts857. sinal de terminação da transcrição sequências para controle da tradução: ex. um sítio de ligação ao ribossomo para a iniciação da tradução, e um ATG iniciador. Um sinal de terminação da tradução (códon de terminação) deve estar presente no vetor ou no inserto a ser clonado, ou deve ser adicionado. Multiplo sitio de clonagem: para facilitar a inserção do gene de interesse na orientação correta. * IPTG (isopropiltiogalactosídeo > analogo a lactose)

13 Por que regular a expressão de um gene? Efeito tóxico da Proteína recombinante: efeito danoso sobre a Bactéria. Monitorar a sua síntese pode impedir a acumulação em níveis tóxicos. Diminuição do nível de transcrição: um nível muito alto pode afetar a capacidade de replicação do plasmídeo recombinante, levando à sua eventual perda na cultura

14 Dentre os vetores utilizados com sucesso para a produção de proteínas híbridas podemos citar: pGEX: apresenta a glutationa-S-transferase de Schistosoma japonicum (26 kDa) como proteína de fusão, permitindo a purificação da proteína de fusão em coluna de agarose-glutationa pMAL: apresenta a proteína ligante de maltose (PLM) de bactéria (42 kDa) como fusão, permitindo a purificação da proteína de fusão em coluna com amilose acoplada pQE: apresenta um tag de 6 resíduos de histidina como fusão e permite a purificação das proteínas de fusão em colunas quelantes de Ni 2+ pUR: cuja fusão é um fragmento da -galactosidase

15 Alguns vetores comerciais: Possibilidades de controle de expressão. Fonte: man.pdf Fonte:

16 Fonte:

17 O vetor de expressão contendo a sequência codificadora da proteína de interesse é introduzido em E.coli por transformação.

18 Q UAL LINHAGEM DE E. COLI UTILIZAR ?

19 Vetores e linhagens comerciais são interessantes, pois permitem: Regular a expressão do gene em estudo; Permitem estabilidade dos RNAm; Diminuição da degradação por não apresentar algumas proteases; Alguns permitem que a purificação da proteína seja mais fácil e/ou eficiente

20 A NÁLISE DOS CLONES CORRETOS ( TRANSFORMADOS ) Fácil selecionar colônias que abrigam os vetores de clonagem usando os marcadores de resistência a antibióticos que estão presentes nos vetores. Difícil selecionar os clones corretos, que possuem o gene de interesse. Vetor plasmídio: deverão ser examinadas milhares de colônias de bactérias crescidas em placas de petri contendo agar, para a detecção daquelas colônias que produzam pequenas quantidades da proteína expressa pelo gene de interesse ou então que possuam o gene de interesse sem qualquer expressão protéica que o caracterize.

21 Q UANDO O GENE É EXPRESSO... identificar o clone que carrega este gene pela presença desta proteína entre as colônias recombinantes. proteína de interesse não for uma enzima com função detectável > uso de um anticorpo específico para a proteína de interesse (antígeno). Limitação: o anticorpo utilizado nesta triagem precisa ser específico para a proteína de interesse Quando o Gene não é expresso... Análise do DNA por eletroforese em gel e blotting DNA é digerido com uma ou mais enzimas de restrição e os fragmentos resultantes separados por eletroforese num gel de agarose. Sequenciamento de DNA PCR

22 Legenda :

23 Um procedimento muito utilizado é o de expressar a proteína de interesse em fusão com um tag específico que permita a fácil purificação da mesma através de cromatografia por afinidade em resinas às quais se encontram acopladas ligantes, aos quais o tag possa se ligar especificamente Está ligado à proteína expressada sem alterar sua atividade específica peptídeo ou polipeptídeo inserido na cadeia que futuramente possa ser reconhecido por um ligante especifico na cromatografia de afinidade deve estar inserido no DNA para q possa ser expressado junto com a proteína

24 Nem sempre essa situação ideal falada anteriormente é atingida! Na maioria das vezes proteínas de eucarioto produzidas em bactéria não são solúveis; podem ser tóxicas para a célula; algumas são expressas em baixos níveis; algumas interferem com a sua fusão inibindo-a de se ligar à resina de afinidade e tornando a purificação menos eficiente.

25 Produção de proteínas intactas A vantagem de se produzir proteína intacta sem fusão é que ela poderá ser utilizada sem a preocupação de que o segmento de fusão esteja interferindo em sua estrutura e atividade. A principal desvantagem é que nem sempre se encontra um método eficaz para a purificação da mesma. Vetores encontram-se disponíveis no mercado para a expressão de proteínas sem fusão em E.coli. Os mais referidos são da série pET (plasmid for expression by T7 RNA polimerase) expressão está sob o controle do promotor de transcrição vantagem deste vetor é que ele é transcrito pela T7 RNA polimerase, a qual é muito seletiva e ativa, sendo capaz de alongar cadeias de RNA aproximadamente 5 vezes mais rápido que a RNA polimerase de E. coli.

26 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS Ao se escolher um sistema de expressão, deve-se sempre considerar a aplicação final da proteína a ser expressa; Algumas proteínas de interesse comercial não são eficientemente expressas em microrganismos procariotos: - conformação incorreta - ausência de modificações pós-traducionais - baixos níveis de expressão Produção de proteínas na sua forma nativa, pois estes sistemas permitem modificações pós-traducionais essenciais para a função de determinadas proteínas. Exemplo: glicosilação;

27 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS Proteínas heterólogas expressas em bactérias em geralmente retêm o resíduo de metionina, derivado do sistema de tradução, na sua extremidade amino-terminal. Nas proteínas expressas em eucariotos essa metionina geralmente faz parte de sinais de endereçamento específicos. Fonte:

28 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS Sistemas de expressão heteróloga : - Leveduras (Saccharomyces cerevisiae/ Pichia pastoris); - Plantas; - Células de mamíferos; - Células de insetos;

29 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS LEVEDURAS As leveduras são fungos que têm sido utilizados pelo homem há milhares de anos. O sistema de expressão eucariótico mais antigo e mais utilizado baseia-se na utilização de leveduras, sendo as espécies Saccharomyces cerevisae e Pichia pastoris as mais utilizadas (Torres & Moraes, 2000).

30 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS LEVEDURAS A utilização de leveduras como um modelo de estudo traz as seguintes vantagens: - Tempo de crescimento reduzido que permite a obtenção de grandes quantidades de leveduras em pouco tempo. - Genoma de pequeno tamanho, cerca de 200 vezes menor que o genoma de mamíferos, o que simplifica análises moleculares e genéticas. - Possibilidade de manter as leveduras como células haplóides ou diplóides, o que permite a obtenção de mutações recessivas em células haplóides, bem como a realização de experimentos de complementação genética.

31 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS LEVEDURAS Existem diferentes marcadores de seleção que são utilizados em leveduras. Um dos marcadores frequentemente utilizados é o gene de levedura LEU2 que codifica a enzima -isopropilmalato dehidrogenase. A linhagem mutante de levedura, leu2, não cresce em meio de cultura que não contém leucina. quando o gene LEU2 é utilizado na transformação da linhagem leu 2, as células desta linhagem que adquiriram o gene LEU2 serão capazes de crescer em meio de cultura deficiente no aminoácido leucina

32 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS LEVEDURA A tabela a seguir lista alguns dos marcadores de seleção comumente utilizados em levedura GENEENZIMASELEÇÃO HIS3Imidazol glicerolfosfato desidratase Histidina LEU2b-Isopropilmalato desidrogenase Leucina LYS2a-Aminoadipato redutase Lisina TRP1 N-(5'-fosforibosil)- antranilato isomerase Triptofano URA3 Orotidina-5'fosfato decarboxilaseUracil Genes marcadores de seleção em levedura. Assim, por exemplo, células transformadas com o gene HIS 3 são selecionadas em meio de cultura deficiente em histidina.

33 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS LEVEDURAS Os vetores utilizados na transformação de leveduras são capazes de se propagar tanto em E. coli quanto em levedura. A manipulação destes vetores (clonagem, mutagênese, sequenciamento, etc) é realizada em bactéria como para qualquer plasmídeo convencional e então é transferido para levedura. Tais vetores são denominados vetores do tipo ponte (shuttle vectors).

34 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS LEVEDURAS - Shuttle vectors Fonte: Fonte: ngton/Project ngton/Project

35 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS LEVEDURAS Diferentes tipos de vetores são utilizados na transformação de leveduras: - Vetores de integração : contêm origem de replicação de bactérias e genes marcadores para seleção em bactéria e levedura. Neste caso o plasmídeo não é capaz de replicar de modo autônomo na levedura. O modo pelo qual este tipo de vetor é propagado e é capaz de expressar o marcador de seleção é através da integração em um dos cromossomos de levedura.

36 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS LEVEDURAS - Vetores que replicam em levedura: Vetores de levedura. Contêm sequências de plasmídeo (aqui de pUC118) que permitem a propagação e dão resistência a ampicilina em E.coli, o gene de seleção em levedura (neste caso LEU 2) e sítios únicos de restrição

37 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS LEVEDURAS - YACs: (Yeast Artificial Chromosome, cromossomo artificial de levedura): YACs: Contêm um centrômero, dois telômeros, gene(s) marcadores para seleção em levedura e uma seqüência tipo ARS. Devido à presença destas seqüências os YACs são replicados como pequenos cromossomos lineares na levedura.

38 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS LEVEDURAS Saccharomyces cerevisiae -considerado um dos microrganismos mais úteis ao homem essa levedura é um dos sistemas eucarióticos mais bem conhecidos. Sua genética é bem dominada e seu genoma foi totalmente sequenciado. -status de microorganismos GRAS (Generally Recognized As Safe) o que é de suma importância no que se refere à produção de biofármacos por engenharia genética.

39 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS LEVEDURAS Pichia pastoris -levedura metilotrófica. -Apresenta duas características que a tornam uma atraente hospedeira para a produção de proteínas heterólogas: Forte promotor derivado do gene da álcool oxidase (AOX1); Não é considerada uma forte fermentadora como S.cerevisiae;

40 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS LEVEDURAS Pichia pastoris - Os vetores de expressão em P.pastoris são geralmente do tipo integrativo: cassete de expressão formado pelo promotor e pela região terminadora de transcrição do gene AOX1 além de uma marca de seleção, sendo a mais utilizada o gene histidinol desidrogenase (HIS4) de P. pastoris. -Um dos vetores mais utilizados é o plasmídio pPIC9:

41 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS PLANTAS As plantas, assim como os animais transgênicos, podem ser empregadas como biorreatores para a produção de proteínas, carboidratos e lipídios em larga escala. Apresentam vias de modificação e processamento pós-traducionais, e os custos da produção de proteínas heterólogas em plantas geralmente são menores que os dos demais sistemas. Por essas razões, o uso de plantas como biorreatores para a produção de proteínas heterólogas está se tornando economicamente importante. A avidina, glicoproteína encontrada em ovos de aves, répteis e anfíbios, e utilizada na produção de reagentes para imunoensaios, constitui a primeira proteína heteróloga produzida em plantas já comercializada (Sigma) (Hood et al., 1997).

42 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS PLANTAS Basicamente, duas diferentes estratégias podem ser utilizadas para a produção de proteínas heterólogas em plantas: Uma delas baseia-se na utilização de vírus contendo RNA simples fita, que ocorrem naturalmente nas plantas. A segunda estratégia consiste em introduzir o gene que codifica a proteína de interesse no genoma da planta por meio de técnicas de transformação, envolvendo, portanto, a obtenção de plantas transgênicas

43 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS PLANTAS Representação esquemática das diferentes estratégias utilizadas na produção de proteínas heterólogas em plantas.

44 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS PLANTAS orientação da expressão para os diversos compartimentos das plantas transgênicas é realizada através da utilização de promotores tecido- específicos e de sinais de direcionamento intracelulares. Essa capacidade tem sido explorada no desenvolvimento de sistemas de produção capazes de simplificar o armazenamento do material colhido e os processos de extração e purificação das proteínas recombinantes. Exemplo de aplicação desse sistema de expressão: Produção de hormônio do crescimento humano em sementes de plantas transgênicas.

45 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS CÉLULAS DE MAMÍFEROS Os vetores para expressão em mamíferos contém sequências para facilitar a propagação em bactéria (origem de replicação e um marcador para seleção), bem como sequências específicas para se obter expressão em células eucarióticas. Vetor de expressão: - origem de replicação para células eucarióticas: por exemplo a do vírus SV40; - promotor: como, por exemplo, do SV40 ou do citomegalovírus (CMV). Existem também vetores com promotores induzíveis como, por exemplo, o da tetraciclina e o responsivo à ecdisona; -sinais para o término da transcrição e para a poliadenilação do transcrito; -marcador para seleção; -sequência para ligação ao ribossomo (sequência de Kozak);

46 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS CÉLULAS DE MAMÍFEROS (Células COS) Realização de modificações pós-traducionais idênticas às naturais. Expressão transitória – expressão obtida sem integração do vetor. Expressão estável – expressão resultante da integração do vetor de expressão num dos cromossomas do hospedeiro. Promotores utilizados na construção de vetores de células de mamífero: -PSV40 (Simian Virus) -PRSV-LTR (Rous Sarcoma Virus) -PMSV-LTR (Murine Sarcoma Virus) -PBPV-1(Bovine Pappilomavirus Type 1) -PCMV (Citomegalovirus)

47 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS CÉLULAS DE INSETOS Utilização do Baculovírus como vetor. Um dos sistemas de expressão em células eucarióticas mais poderosos e versáteis. Necessário uso de vetores de transferência (sequências flanqueadoras homólogas (5 e 3 ao inserto desejado) ao genoma do Baculovírus). Co-transfecção do vetor de transferência contendo o gene de interesse clonado e do DNA linearizado do vírus Autographa californica (AcNPV) em células do inseto. Ocorre recombinação homóloga, com transferência do gene heterólogo do vetor para o DNA do AcNPV. A infecção das células com o DNA do vírus resulta na parada total da expressão das proteínas do hospedeiro, permitindo alta produção do mRNA e da proteína recombinantes.

48 E XPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM EUCARIOTOS CÉLULAS DE INSETOS Uma variedade de vetores de transferência foram construídos para utilização neste sistema. Cada vetor contem : -Uma origem de replicação de E.coli; -Um marcador de resistência à ampicilina; -O promotor da polihedrina ou da p10 (proteínas do baculovírus): promotores fortes.; -Um MSC para permitir inserção do gene de interesse; -Sequências flanqueadoras pertencentes ao genoma do vírus para facilitar a recombinação homóloga;

49 P URIFICAÇÃO DE P ROTEÍNAS Os mais poderosos métodos para fracionamento de proteínas utilizam cromatografia em coluna, que tem como base as diferenças no tamanho, carga, afinidade de ligação e outras propriedades de proteínas. São elas: Explora as diferenças no sinal e na magnitude da carga elétrica líquida Separa as proteínas de acordo com seu tamanho cromatografia de troca iônica cromatografia de exclusão pelo tamanho cromatografia de afinidade

50 C ROMATOGRAFIA POR AFINIDADE A cromatografia de afinidade é um dos métodos mais eficazes disponíveis para a purificação de proteínas Infelizmente, há muitas proteínas para as quais não há nenhum ligante conhecido que possa ser convenientemente imobilizado em um meio cromatográfico O uso de proteínas de fusão torna possível purificar praticamente qualquer proteína por cromatografia de afinidade O produto da fusão de 2 genes diferentes, ligados para criar novas combinações

51 C ROMATOGRAFIA POR AFINIDADE Gene que codifica a proteína-alvo é fusionado a um gene que codifica um peptídeo ou proteína, que interage com alta afinidade e especificidade com um ligante conhecido O peptídeo/proteína pode estar ligado a extremidade C ou N chamado de marcador terminal Marcadores proteicos/peptídicos Massa molecular (kDa)Ligante imobilizado Proteína A59Porção Fc da IgG (His) 6 0,8Ni 2+ Glutationa-S-transferase (GST) 26Glutationa Proteína ligante de maltose 41Maltose B-galactosidadee116 p-Aminofinil-B-D- tiogalactosídeo Domínio ligante de quitina 5,7Quitina

52 C ROMATOGRAFIA POR AFINIDADE Exemplo: GST pequena enzima que se liga fortemente e de modo específico, ás moléculas de glutationa. Se a sequência do gene da GST for fusionada ao gene-alvo, a proteína de fusão adquire a capacidade de ligar a glutationa. Uma coluna é preenchida com uma matriz porosa consistindo em um ligante imobilizado por esferas microscópicas de um polímero estável em ligações cruzadas. A medida que o extrato bruto permeia a matriz da coluna, a proteína de fusão fica imobilizada pela ligação a glutationa. As outras proteínas são lavadas da coluna e descartadas. Como a interação entre GST e glutationa não é covalente, a proteína de fusão é eluída suavemente da coluna usando uma solução que contém uma alta concentração de sais ou glutationa livre.

53 GST se liga à glutatinona GST marcadora é fusionada, por engenharia genética, ao resíduo carboxiterminal da proteína alvo. A proteína com o marcador é expressa e estará presente no extrato bruto quando as células forem lisadas. O extrato é submetido a cromatografia em uma coluna contendo um meio com glutationa, retardando sua migração pela coluna, enquanto outras proteínas são rapidamente lavadas. A proteína com o marcador é subsequentemente eluída da coluna com uma solução contendo elevada concentração de sal ou glutationa livre

54 E STUDO DE C ASO

55 C LONAGEM E EXPRESSÃO HETERÓLOGA DA CATALASE DE 61 K D A DO FUNGO P ARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS Y URI DE A BREU M ENDONÇA E C ÉLIA M ARIA DE A LMEIDA S OARES Paracaccidioides brasiliensis agente etiológico de uma microse conhecida como papacoccidioidomicose afeta principalm. população rural da Am. Latina Produção de catalase estratégia usada por vários micro-organismos contra a toxicidade dos oxidantes produzidos pelas células fagocitárias durante a resp imune Identificada uma catalase de 61 kDa reativa com soros de pacientes com PCM Rastreamento de biblioteca de cDNA sequência de 2016 nucleotídeos (Pb catP) contendo uma ORF de 1509pb Indução da expressão da proteína quando exposta ao susbstrato (peróxido de hidrogênio) Estudos prévios: esta catalase desempenha papel antigênico em P. prasiliensis Codifica uma proteína de 502 aminoácidos, 57 kDa

56 O BJETIVOS Clonar o cDNA codificante da catalase de 61 kDa do fungo P. brasiliensis em vetor de expressão Induzir a expressão heteróloga da catalase de 61 kDa (Pb CATP) deste fungo Purificar a proteína recombinante Analisar a reatividade imunológica e da atividade catalítica da catalase recombinante deste fungo através de Western blot. identificar a presença de proteínas específicas em amostras separadas electroforeticamente

57 M ETODOLOGIA

58 C ONSTRUÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS PARA CLONAGEM EM P ET® 19B Foram construídos 2 oligonucleotídeos baseados na sequência do vetor descrita no pET System Manual Clonar o cDNA codificante da catalase no vetor de expressão pET® 19B Expressão da proteína recombinante em sistema heterólogo

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60 R EAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) Montagem de um sistema contendo: 1,5 uL dos oligonucleotídeos CAT1 e CAT2 (1mM) 5 uL de DNA plasmidial (Pb catP) codificante para a catalase P. (10ng/uL) 1,5 de dNTPs (2,5mM) 1 uL de Taq DNA Polimerase 1 uL de MgSO4 (50mM) Água Mlli-Q q.s.p. vol final 50 uL DNA molde desnaturado a 94ºC por 2 min; 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 45 seg, anelamento a 58ºC por 1 min, extensão por 1 min e 30 seg a 72ºC. Obteve-se um fragmento de 1510 foi obtido utilizado na clonagem no vetor de expressão pET® 19B.

61 C LONAGEM DO C DNA EM VETOR DE EXPRESSÃO P ET® 19B Clonou-se o cDNA no vetor de expressão pET® 19B através de um sistema de ligação contendo: 50 ng de DNA do vetor digerido com endonucleases BamH I e Xho I 250 ng de cDNA de catalase P. T4 DNA ligase (2U/uL) Tampão da enzima para 1 X Água Milli-Q para vol final de 10 uL Transformação de células de Escherichia coli BL21(DE3) Dos clones obtidos, 4 apresentavam os vetores com o inserto desejado denominados CAT2, CAT5, CAT7 e CAT9.

62 I NDUÇÃO DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE Uso do Overnight Autoinduction Systems Disponibiliza 2 sistemas de indução Apresenta desempenho semelhante a protocolos convencionais de indução utilizando IPTG. Não é necessário monitoramento do crescimento celular Overnight Express System 1 OnEX Solution 1OnEX Solution 2OnEX Solution 3 - Mistura de diversas fontes de C - Regular o crescim. celular sem indução até uma alta densidade de células, seguindo por um alto índice de indução por lactose - Tampão concentrado que mantém o pH durante a produção de ác. Metabólicos - Proporciona N 2 adicional necessário para a sustentação do aumento da síntese protéica - Fornece o magnésio crítico para a densidade celular máxima

63 É extremamente conveniente para a expressão de proteínas de rotina de várias culturas e é ideal para análise paralela de alto rendimento de expressão da proteína, solubilidade, e purificação a partir de vários clones de expressão. Permite a expressão da proteína regulada em E. coli, sem controle da cultura ou adição de indutor do crescimento celular. O método baseia-se nos componentes do meio que são metabolizados diferencialmente para promover o crescimento de alta densidade e induz automaticamente a expressão da proteína a partir de promotores lac. Overnight Express Autoinduction Systems

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65 I NDUÇÃO DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE Adicionou-se: 600 ul da OnEX Solution 1 1,5 ml da OnEX Solution 2 30 ul da OnEX Solution 3 Ampicilina para concentração final de 100 ug/ml Meio LB líquido para um vol final de 30ml em frascos de 250ml Montou-se 5 sistemas de indução As culturas foram incubadas em shaker a 37ºC, 250 rpm por 16h Centrifugação das culturas para obtenção do precipitado de células conservados a -20ºC única colônia de cada clone com o fragmento da calatase clonado (CAT 2, CAT 5, CAT 7 e CAT 9) Um clone destituído deste fragmento 4 contendo: 1 contendo:

66 R ESULTADOS E D ISCUSSÃO

67 C ONFIRMAÇÃO DOS CLONES POSITIVOS Primeira marca de seleção adição de antibiótico no meio de cultura durante o plaqueamento A partir destes clones sequenciamento da região alvo do vetor Clones CAT 2, CAT 5, CAT 7 e CAT 9 apresentaram a sequência desejada Observou-se uma mínima taxa de expressão da proteína alvo durante os ciclos de cultivo de células contendo um vetor de expressão com um inserto condificante para esta proteína Confirmar se o cDNA codificante para a catalase estava realmente clonado

68 C ONFIRMAÇÃO DOS CLONES POSITIVOS o inserto codifica uma proteína que é toxina para a célula, há uma tendência que a sequência seja recombinada e desapareça da pop de células da cultura Uma forma de barrar este processo: adicionar um inibidor (no caso glicose 2mM) Para verificar se o inserto de 1,5kb mantinha-se clonado no vetor, fez-se um sistema de digestão a 37ºC por 16h com as enzimas Xho I e BamH I a partir do DNA plasmidial de cada clone Digestão eletroforese (gel de agarose 0,8%) resultados positivos Da transformação (E. coli BL21) foram feitas 4 placas bom crescimento celularQuando

69 I NDUÇÃO E RASTREAMENTO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE 5 sistemas de indução 4 sistemas nos quais foi adicionado glicose 2mM substância inibidora da síntese protéica no vetor pET 19B não foram adicionados as soluções do kit (OnEx Solution 1, 2 e 3 controle de expressão para cada clone (não induzido) Outros 4 sistemas um para cada clone (CAT 2, CAT 5, CAT 7 e CAT 9) Precipitados de células obtidos no processo foram fervidos por 10min e aplicados em gel de poliacrilamida Nenhum clone apresentou a proteína esperada de 61 kDa. Mostraria o padrão de expressão protéica da célula e do vetor SEM o fragmento da catalase

70 C ONCLUSÃO A clonagem do cDNA e a expressão heteróloga da catalase peroxissomal recombinante irá viabilizar novas análises sobre o papel da catalase de 61 kDa na resposta imune, assim como estudos funcionais acerca dos papéis da proteína no fungo P. brasiliensis.

71 O BRIGADA O BRIGADA !


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