Ação do hormônio tireoidiano e de seu receptor sobre o promotor do fator de necrose tumoral alfa Nome: Fellipe Erick Campos Orientadora: Angélica Amorin.

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1 Ação do hormônio tireoidiano e de seu receptor sobre o promotor do fator de necrose tumoral alfa
Nome: Fellipe Erick Campos Orientadora: Angélica Amorin Amato

2 Eixo hipotálamo-hipófise-tireoide
T4 + T3 Circulação Tecidos Tecidos

3 Efeitos fisiológicos do hormônio tireoidiano
Desenvolvimento Homeostase Proliferação e diferenciação celular Sistema Nervoso Central Função reprodutiva SNC SNC A IMPORTÂNCIA DOS HORMÔNIOS tireoideanos (HTs) no desenvolvimento, homeostase, proliferação e diferenciação celular tem sido bem documentada. Sabe-se que, nos mamíferos, os HTs atuam em todos os órgãos e vias metabólicas e seus principais efeitos incluem o desenvolvimento de vários tecidos, como o do sistema nervoso central, consumo de oxigênio, regulação da temperatura corporal, freqüência cardíaca e também o metabolismo de carboidratos, proteínas e gorduras. Além disso, participam da síntese e a degradação de muitos outros fatores de crescimento e hormônios, o que resulta em outros efeitos secundários (1,2). Consumo de oxigênio Frequência cardíaca Temperatura corporal Atividade de outros hormônios Metabolismo de nutrientes

4 Mecanismo de ação do hormônio tireoidiano
Histonas desacetiladas + T3 Na ausência do hormônio a ligação de correpressores ocorrendo um silenciamento da transcrição. Na presença do hormônio a uma mudança conformacional do receptor que resulta em desligamento dos correpressores e recrutamento dos co-ativadores e da maquinaria transcrição basal com a transcrição dos genes alvo. Transcrição Histonas acetiladas

5 Deficiência x excesso de hormônio tireoidiano
HIPOTIREOIDISMO Bradicardia Pele ressecada e fria Hipoglicemia Hipercolesterolemia Redução da taxa metabólica basal HIPERTIREOIDISMO Taquicardia Pele quente e úmida Hiperglicemia Hipocolesterolemia Aumento da taxa metabólica basal Excesso e falta da ação do hormônio tireoidiano: modelos que permitem entender efeitos do hormônio e sua importância

6 Hipotireoidismo x doença cardiovascular
Hipotireoidismo franco e aparelho cardiovascular  frequência e contratilidade cardíaca  expressão de genes que codificam enzimas que regulam contratilidade e relaxamento cardíaco Thyroid hormone and the cardiovascular system: from theory to practice. J Clin Endocrinol Metab 1994; 78:1026. Biochemical basis of thyroid hormone action in the heart. Am J Med 1990; 88:626.

7 Hipotireoidismo x doença cardiovascular
Hipotireoidismo subclínico e aparelho cardiovascular  incidência de doença aterosclerótica  mortalidade cardiovascular Subclinical hypothyroidism is an independent risk factor for atherosclerosis and myocardial infarction in elderly women: the Rotterdam Study. Ann Intern Med 2000: 132:270. Risk for ischemic heart disease and all-cause mortality in subclinical hypothyroidism. J Clin Endocrinol Metab 2004; 89: 3365. Subclinical hypothyrodism is associated with a low-grade inflammation, increased triglyceride levels and predicts cardiovascular disease in males below 50 years. Clin Endocrinol (Oxf) 2004; 61:232. Impaired endothelium-dependent vasodilation in subclinical hypothyroidism: beneficial effect of levothyroxine therapy. J Clin Endocrinol Metab 2003; 88:3731

8 Por que o hipotireoidismo aumenta o risco de doença cardiovascular?
 resistência vascular periférica  piora de hipertensão arterial sistêmica Hipercolesterolemia Hiperhomocisteinemia Será que o hormônio tireoidiano com a ação do seu receptor influenciaria no processo inflamatório? Essa poderia ser a explicação da deficiência de hormônios tireoidianos e doença cardiovascular? Doença cardiovascular aterosclerótica x inflamação sistêmica O hormônio tireoidiano e seu receptor poderiam influenciar o processo inflamatório?

9 Há outras condições que compartilham alterações do eixo HHT e alterações inflamatórias?

10 Síndrome do T3 baixo Função tireoidiana em doenças não tireoidianas
TSH normal ou baixo Correlação  T3 e marcadores inflamatórios Association between serum interleukin-6 and serum 3,5,3’-triiodothyronine in nonthyroidal illness. J Clin Endocrinol Metab 1993;77(6):1695–9. Relationship of the increased serum interleukin-6 concentration to changes of thyroid function in nonthyroidal illness. J Endocrinol Invest 1994;17:269–74. Role of cytokines in the pathogenesis of the euthyroid sick syndrome. Eur J Endocrinol 1998; 138:603–14. Relating circulating thyroid hormone concentrations to serum interleukins-6 and -10 in association with non-thyroidal illnesses including chronic renal insufficiency. BMC Endocr Disord 2008;8:1.

11 Insuficiência cardíaca
Correlação negativa T3 x IL-6, TNF- e proteína C reativa P < 0,05, r = -0,14 Controle T3L > 2 T3L < 2 T3L (pg/mL) TNFa (pg/mL) Relationship between triiodothyronine and proinflammatory cytokines in chronic heart failure. Biomedicine & Pharmacotherapy 2010; 64:

12 Doença renal crônica Função tireoidiana na doença renal crônica  T3
TSH normal, T3 reverso normal Correlação  T3 x marcadores inflamatórios (IL-6, TFN-alfa)e sobrevida Clinical and biochemical implications of low thyroid hormone levels (total and free forms) in euthyroid patients with chronic kidney disease. J Intern Med 2007; 262:690–701. Low triiodothyronine: a new facet of inflammation in end-stage renal disease. J Am Soc Nephrol 2005; 16: 2789–2795. Low triiodothyronine and survival in end-stage renal disease. Kidney Int 2006; 70:523–528. Subclinical hypothyroidism is linked to micro-inflammation and predicts death in continuous ambulatory peritoneal dialysis. Nephrol Dial Transplant 2007; 22:538–544.

13 Hormônio tireoidiano x inflamação
Relação causa – efeito? Direcionalidade?

14 Receptores Nucleares O que são?
Uma superfamília  48 genes  75 proteínas São complexos de sinalização que atuam de várias maneiras, modulando a ativação e a repressão de sinais.

15 Domínio carboxi - terminal Domínio amino - terminal
Dobradiça (Hinge) Domínio carboxi - terminal Domínio amino - terminal A/B C D E F AF - 1 DBD LBD Ligação ao DNA Ligante Transativação Ligação ao ligante

16 Mecanismo de ação do hormônio tireoidiano
Histonas desacetiladas + T3 Na ausência do hormônio a ligação de correpressores ocorrendo um silenciamento da transcrição. Na presença do hormônio a uma mudança conformacional do receptor que resulta em desligamento dos correpressores e recrutamento dos co-ativadores e da maquinaria transcrição basal com a transcrição dos genes alvo. Transcrição Histonas acetiladas

17 Macrófagos e monócitos
Modelo de estudo Fator de necrose tumoral alfa (TNF-) Inflamação sistêmica Macrófagos e monócitos Indução de apoptose e inibição de tumorigênese Receptor de membrana Adipócitos, células mesangiais Inibição da replicação viral Tumor necrosis factor Fator de necrose tumoral alfa é uma citocina envolvida na inflamação sistêmica e é membro de um grupo de citocinas que estimula a reação de fase aguda. São produzidas em macrófagos e monócitos e/ou adipócitos e células mesangiais e atuam em receptores de membrana. Sua função é na regulação das células imunes capazes de induzir a inflamação sistêmica, induzirem morte celular por apoptose, inibir também a tumorigênese e inibição da replicação viral. Isso está relacionado às doenças humanas como resistência insulínica, síndrome metabólica e doença cardiovascular aterosclerótica. Dysregulation and, in particular, overproduction of TNF have been implicated in a variety of human diseases, as well as cancer.[1] Recombinant TNF is used as an immunostimulant under the INN tasonermin. Doenças humanas Resistência insulínica, síndrome metabólica, doença cardiovascular aterosclerótica

18 Objetivo Objetivo Geral: Objetivos Específicos:
Estudar o efeito do T3 e de seu receptor sobre a atividade transcricional no promotor do gene do TNF-α e esclarecer os mecanismos moleculares envolvidos na regulação desse gene. Objetivos Específicos: Estudar o efeito do T3 na regulação da atividade transcricional do receptor do hormônio tireoidiano no promotor do gene do TNFα. Estudar o efeito das diferentes isoformas de TR (TRα e TRβ). Avaliar a importância da interação direta de TR com o promotor do TNFα. Avaliar o efeito do T3 na síntese de proteína TNFα.

19 Construções de plasmídeos repórteres contendo promotor do TNF (inteiro ou fragmentos)
-125 LUC -82 TNF RE -1044 (-125/-82) 3X +93 TK Esse é um plasmídeo utilizado pelo Tiago, onde a um promotor completo e fragmentos.

20 TR e (-1044) TNF-Luc Células U937 b a c - + Taxa de ativação LUC
Receptor 1 mcg + (-1044)TNF-Luc 4 mcg 25 50 75 100 125 150 175 vetor vazio TR alfa TR beta LBDTR beta T3 100 mM + - a b c Taxa de ativação Células U937 LUC -1044 +93

21 Transfecção O que é? Introdução de moléculas exógenas em células DNA plasmidial Em geral, a transfecção é seguida pela expressão de um ou mais genes presentes no DNA introduzido Ensaio de gene repórter Métodos Precipitação do fosfato de cálcio Lipossomos Eletroporação

22 Ensaio Gene Repórter Pra que serve o ensaio?
Para estudar a expressão dos genes Avaliando o efeito de uma seqüência regulatória de um determinado gene O que podemos realizar com o ensaio? Delimitar os elementos regulatórios Avaliar os efeitos de agentes hormonais Estudar impactos em mutações gênicas

23 Procedimento Processos: Lavagem (PBS 1x); Tripsina (0,5%);
DMEN inibir a Tripsina Centrifugar: 5 min a 2000 rpm.

24 Procedimento Pellet: células Sobrenadante: meio de cultura
Suspensão das células em solução tampão (PBS, cálcio, glicose)

25 + 500 L suspensão de células
Mistura da suspensão de células ao DNA plasmidial Transferência da suspensão de células + DNA plasmidial para cuvetas de 0,4 cm Eletroporação DNA plasmidial TR TRE-luciferase + 500 L suspensão de células (10 x 106 células) 500 L /cuveta (10 x 106 células) 950 F e 0,3 kV

26 Ressuspensão das células eletroporadas em meio de cultura Distribuição da suspensão de células em placas de 12 poços e tratamentos 1 mL/poço Veículo T3 10-5M T3 10-6M T3 10-7M

27 Avaliação da expressão do gene repórter
37oC e 5% CO2 24h Luminômetro As células transfectadas e tratadas são incubadas durante 24h a 37 graus e em ambiente com 5% de CO2, e depois desse período de tempo são recoletadas, o conteúdo de cada poço é colocado em um tubo de 1,5 mL. Esses tubos são centrifugados para separar as células do meio de cultura, o meio de cultura é desprezado, e as células são lisadas pela adição de um tampão de lise. A lise celular permite que toda a luciferase que tenha sido produzida pelas células seja exposta para avaliação de sua atividae. Para avaliar a atividade da enzima, são misturados 20 mcL do lisado de células e 20 mcL do substrato da luciferase. O que se espera com isso? 10 μL do lisado celular + 10 μL do substrato da enzima luciferase

28 Células U-937 LUC -1044 +93

29 Células U-937 LUC -1044 +93

30 Células U-937 -125 LUC -82 TNF RE -1044 (-125/-82) 3X +93 TK

31 Células U-937 -125 LUC -82 TNF RE -1044 (-125/-82) 3X +93 TK

32 O TR interage diretamente com o promotor do TNF-?
Ensaio de anisotropia de fluorescência wtTNFRE (CACTACCGCTTCCTCCAGATGAGCTCATGGGTTTCTCCACCAAG) + Para minha surpresa DBD se ligou melhor a sequencia mutada. Alem disto, o DBD tem uma leve tendencia para se ligar como dimero, Hill Coef maior que 1, e se liga claramente como monomero na sequencia mutada.  Bom, achei muito interessante, pois se o DBD se liga aquela sequencia degenerada que vcs apontaram, que fica 1 bp upstream do nTRE (GGGTTT), este sitio poderia ser responsavel pela ligacao do DBD na forma dimerica.  Do ponto de vista biofisico e talvez biologico, isto seria muito legal investigar com mais detalhes, digo, estamos vendo um  dimero onde um monomero se liga maior afinidade que o outro.  Mas isto tudo eh especulacao, pois temos mutar o outro sitio degenerado, e tb uma dupla mutacao dos dois sitios... Vou tentar fazer isto em breve... DBD-TR

33 Próximos passos… Ensaios de gene repórter com mutantes do TRb
L422R (Mutante do TR beta – Leucina 422 trocada por uma Arginina) – diminuição da capacidade de dimerização Ensaios de gene repórter com mutantes do TRb Papel da dimerização na repressão do promotor do TNFa: L422R Papel da superfície de interação com correpressores na repressão do promotor do TNFa: G345R e F451X. Avaliação da expressão do TNFa em resposta ao tratamento com T3 Cultura de células: células mesangiais humanas Interação TR e promotor do TNFa in vitro (gel shift) G345R (Mutante no domínio de Ligação ao Ligante – LBD – Glicina 355 trocada por uma Arginina) – perda da afinidade do TR ao T3, não afetando ligação de dímeros ao TREs. F451X (Mutante TR beta – 10 ultimos aa apartir da Fenilalanina 451, foram deletados – Hélice 12 foi eliminado, superfície de ligação ao correpressor foi exposta. )

34 Obrigado!!!