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Q-TOF Quadrople Time of Fligth Mass Espectomotry Resultados Seqüenciamento de Proteínas Lucas Brandão UFRPE.

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1 Q-TOF Quadrople Time of Fligth Mass Espectomotry Resultados Seqüenciamento de Proteínas Lucas Brandão UFRPE

2 Espectrômetro de Massa

3 Existem diversas plataformas para análise em espectrometria de massa – Várias configurações possíveis. A primeira pergunta – Qual a diferença principal nos resultados entre os q-TOF para outras plataformas?

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5 Conclusão Q-TOF é muito mais sensível e com um poder de resolução muito maior MAIOR – Sensibilidade – Resolução – acurácia

6 Quadropole-Time of Flight Devido as vantagens do espectro de TOF ele é utilizado como analisador Assim o quadropole pode ser usado como um filtro de massa que transmite apenas o íon parente (precursores) de interesse Todos os espectros de massas obtidos tanto no MS, quanto MS/MS mode, são gravados com um TDC (time-to-digital converter) Q-TOF pode ser utlizado tanto no modo MS, quanto no modo MS/MS

7 Segunda pergunta: – O que pode influenciar no resultado final de um q- TOF? Ionização positiva Ionização negativa TCD (time-to-digital converter)

8 Perguntas que se deve fazer Amostra: – como será processada? – Qual a procedência? Ionização: – Positiva ou negativa? – ESI ou MALDI? MAIOR Sensibilidade Resolução acurácia

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10 Tipos de dados O principal tipo de dado que um espectrômetro de massas produz é um – Espectro de massa Espectro de massa Cromatograma de massa selected ion monitoring (SIM), total ion current (TIC), selected reaction monitoring chromatogram (SRM)

11 Espectro de Massa MS m/z Intensidade

12 Resolução de Massa Definição: como a separação de duas massas pela espectrometria de massa. Sendo diretamente proporcional a acurácia M1 = 2,0157 M2 = 1,9793

13 Resolução de Massa Quanto mais estreito o pico, maior é a resolução e maior a precisão em determinar m/z Full width at half maximum Definição: como a separação de duas massas pela espectrometria de massa. Sendo diretamente proporcional a acurácia

14 M1 = 2,0157 M2 = 1,9793 M1-M2 = Resolução = (286/0.0364) = 7857 Resolução de Massa

15 Comparação entre alta e baixa resolução Baixa resolução: Um único pico BAIXA RESOLUÇÃO: Amostra com contaminantes mas apenas um único pico ALTA RESOLUÇÃO: Amostra com contaminante sendo mostrado com dois picos

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17 Seqüenciamento de Proteínas

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19 Overview

20 Q-TOF Duas possibilidades Modo MSModo MS/MS

21 Resultados em MS mode Produz um mapa peptídico (peptide map) ou PMF (peptide mass fingerprint) – A proteína foi tripsinizada e depois analisada pela MS, sem a necessidade de ocorrer a separação (filtro) de íons – Se a proteína já existe ele será encontrada no banco de dados.

22 Resultados em MS/MS mode Caso da caracterização pelo peptide map, não seja suficiente para determinar a proteína, Pode ser realizada a separação, fragmentação dos íons selecionados e em seguida ocorrer a analise pelo TOF.

23 Modo MS/MS Para fazer esta analise é necessário realizar a seleção do íon precursor – Visto que o volume de dados impossibilita a aquisição de todos os íons num único espectro de massa – Tomar a decisão de qual íon precursor deve ser selecionado

24 Critérios Intensidade Status da carga m/z Depois que ocorre a seleção do íon precursor, o modo MS/MS é automaticamente ligado Após um determinado período ou até que que um certo critério seja preenchido o sistema retorna ao modo MS E permanece nesse modo (MS) até que outro íon precursor seja novamente selecionado

25 Seleção e fragmentação

26 Ou seja... Uma corrida – Dura 70mim – 350 espectros de massa (TOF) Muitos picos: solventes, contaminantes e íons de peptídeos.

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29 De novo seqüenciamento O Papel da câmera de colisão

30 Seqüenciamento de Proteínas Para seqüenciar peptídeos é necessário realizar a sua fragmentação – Podem existir 3 tipos de quebras de ligações diferentes NH-CH, CH-CO, e a ligação CO-NH – Cada fragmentação da origem a duas espécies Uma neutra E outra carregada

31 A fragmentação acontece de maneira randômica e não seqüencial Além disso, algumas fragmentações são preferidas em relação a outras – Por isso se encontra sinais de intensidades diferentes

32 Fragmentação peptídica e nomenclatura Íons b = no amino terminal y = no carboxil terminal A questão é que a fragmentação peptidica não acontece de forma sequencial

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34 Íons b Íons y

35 Os íons b e y são utilizados para fazer o seqüenciamentos de um peptídeo.

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37 OUTRO EXEMPLO

38 O Que fazer? 1- Olhar para os imunoíons menores: Provaveis a.a. Presentes no peptídeo. 2 – olhar para o íon precursor:

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46 OBRIGADO PELA ATENÇÃO


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