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Malárias humanas Plasmodium. Vetor e hospedeiro definitivo: Anopheles spec. Na África: Anopheles gambiae No Brasíl: Anopheles darlingii reinofilosubfiloclasseordemsubordemgênero.

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1 Malárias humanas Plasmodium

2 Vetor e hospedeiro definitivo: Anopheles spec. Na África: Anopheles gambiae No Brasíl: Anopheles darlingii reinofilosubfiloclasseordemsubordemgênero e espécie Protozoa Apicomplexa Sporozoa Coccidia Eucoccidiida Haemosporina Plasmodiidae Plasmodium vivax P. falciparum P. ovale P. malariae P. knowlesi Taxonomia dos plasmódios

3 -Dizimou as populações desde o começo da civilização (“Mal ar”) -Parasita foi decoberto por Laveran (1880), Golgi descreveu em 1885 a esquizogonia eritrocítica, Pfeiffer reconheceu a relação biológica dos plasmódios com os outros coccídeos -Manson sugeriu a transmissão vetorial que Ross comprovou em Grassi demonstrou que somente a fêmea dos Anofelinos transmite os plasmódios -A fase hepática da infecção foi comprovada somente em 1948 por Shortt e colegas, forma hepática visualizada nos anos 80 - Foi erradicada na Europa somente depois da segunda guerra mundial Malária e Plasmodium : Dados históricos - A transmissão pode se espalhar para áreas antes não acometidas com o aquecimento global, migrações e invasão de áreas florestais sem políticas públicas de prevenção

4 Distribuição da Malaria 1946 (Guerra et al. 2008)

5 2007 Distribuição da Malaria

6 Número de casos ( x 1000) Casos de malária no Brasil vs. espécie (1970 a 2009) Aproximadamente 75% P.vivax. Fonte de dados: SISMAL e SIVEP-Malária, excluídas LVC

7 Ciclo eritrocítico Fase hepática Inseto Fase hepática Ciclo eritrocitário Ciclo de vida do parasita

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9 A infecção Kappe et al. TIP 2003

10 Movimento de esporozoitas na pele Invasão de vasos sangüíneos

11 Esporozoítas invadem células de duas maneiras: - invasão temporária - invasão definitiva O contato com citossol de células é necessário para capacitar os esporozoitas à invasão definitiva da célula hepática Kappe et al. TIP 2003 CD81

12 O desenvolvimento do esporozoíta na célula hepática ocorre dentro do vacúolo parasitóforo Dia 1 pós infecção Fluxo sangüíneo CK

13 Dia 3 pós infecção O esporozoita se divide em um processo especial de divisão celular: a esquizogonia

14 Dia 5 pós infecção

15 Após 7-10 dias, a célula hepática morre e libera merozoítas empacotados em “merossomos” ao fluxo sangüíneo Sturm et al. 2006, Science 313, p 1287f

16 Esporozoítas de Plasmodium vivax e ovale podem não entrar em multiplicação mas ficar por semanas/meses e raramente anos em estágio dormente (hipnozoíta) Dia 1 dia 48 dia 221 dia 225 ?

17 O merozoíta Bannister et al. TIP

18 - A invasão da hemácia é facilitada pela secreção de enzimas contidas na róptria e nas micronemas - A interação firme/invasão depende de proteínas da superfície do merozoíta e da hemácia: P. vivax: Duffy binding protein 1 e 2 e fator Duffy* SOMENTE P. falciparum: EBA-175 (e parálogas), RH5 e glicoforinas, Basigina, respectivamente Hemácias de Negros não possuem o fator Duffy! Por isso pouco P. vivax na África (vantagem evolutiva)

19

20 O ciclo sangüíneo começa com a forma “anel” do parasita (P. falciparum : 2~12 horas após infecção), dentro de um vacúolo Bannister et al. TIP

21 No trofozoíta, o DNA começa a ser replicado e a hemácia infectada profundamente reestruturada (instalação de um sistema de secreção no citossol da hemácia), pigmento (heme polimerizado) é acumulado (14~36 h)

22 - Durante o crescimento do plasmódio, hemoglobina da hemácia é metabolizada para fornecimento de energia e metabolitos e para manter a pressão osmótica hemoglobina > aminoácidos + heme--> polímero (hemozoína) energia e/ou síntese protéica do plasmódio

23 No esquizonte, começa a formação de novos merozoítas (36-46 h) Bannister et al. TIP 2000

24 A liberação dos merozoítas ocorre em dois passos mediados por proteases diferentes do plasmódio -Ruptura do vacúolo parasitóforo - Ruptura da hemacia

25 Durante o ciclo sangüíneo alguns parasitas se desenvolvem para formas sexuadas (Gamontogonia-> gametócitos)

26 Eventualmente, o indivíduo infectado vai para um criadouro de Anofelinos...

27 ...e vira “jantar”

28 Vetores e não-vetores de Plasmodium vivax e falciparum Anopheles gambiae Anopheles darlingi

29 2n Membrana peritrófica

30 Penetração do oocineto pela matriz peritrófica é mediada por quitinases do plasmódio microvilosidades sangue OOCINETO MATRIZ PERITRÓFICA Trends in Parasitol 17: , 2001 Se o parasita não sair da matriz peritrófica, é eliminado

31 2n R! Lumen intestinal hemolinfa Se o pernilongo melanizar esta célula antes da hora, a infecção é eliminada “Time bomb model”

32 Oocistos de Plasmodium gallinaceum SEM

33 Esporogonia

34 Lumen intestinal hemolinfa Interação receptor- ligante, MAEBL + CS + proteina Saglina O “estouro” dos oocistos é assincrônico, do gametócito até o esporozoita na glândula salivaria demora 8-15 dias

35 ~14 dias depois, um outro indivíduo vai para um criadouro de Anofelinos...

36 ...e é picado

37 - vetores competentes - condições ecológicos apropriados para os vetores - temperatura média acima 16-20°C - indivíduos infectados (-> fonte de gametócitos!) ! ! P. falciparum : A parasitemia tem que ser mantida em indivíduos infectados Fatores importantes na transmissão Não é zoonose

38 Curva de Parasitemia e febre de um paciente não-immune ---> Aquisição da imunidade protetora mas não esterilizante demora em torno de 5-10 anos (Staalsoe e Hviid, Parasitology Today 1998)

39 O que é uma resposta protetora encontrada em pessoas da área endémica? - Resposta humoral: Anticorpos contra determinados antígenos do merozoita: MSP1, MSP3, GLURP, EBA175 e outros, subclasses citofílicos de anticorpos - Associação não muito clara com o tipo da resposta Th1/Th2 - Resposta células T plus IFN  contra antígenos do estágio hepático - Anticorpos contra a superfície da hemácia infectada (PfEMP1, RIFIN, e outros) - Imunidade estéril naturalmente muito rara ou inexistente

40 - crescimento intracelular em células com pouco ou sem apresentação em MHC1 - Não deixar a hemácia infectada passar pelo baço: citoaderência (apenas P. falciparum) e variação antigênica - interferência imunológica: anergia, inibição da resposta celular contra estágios sanguineos (o parasita não é eliminado por completo), o sistema imunológico deixa de reagir ao parasita (parecido com cancer – exaustão clonal) Estratégias do plasmódio de evitar/modular a resposta imunológica do hospedeiro

41 Plasmodium falciparum: Formas maduras não se encontram no fluxo sanguíneo

42 Hemácias infectadas com formas >20 h após reinvasão tem protrusões (“knobs”)

43 Capillary endothelial cells baço Proteínas no knobs (PfEMP1s) se ligam a receptores em células endoteliais

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46 As proteínas associadas as knobs e responsáveis pela citoaderência possuem domínios altamente variáveis, mas as regiões responsáveis pela ligação são conservadas, porém, parecem pouco imunogênicas Superficie do knob PfEMP1

47 - Por genoma de Plasmodium falciparum, existem ca. 50 cópias diferentes de genes que codificam para PfEMP1s - Somente uma espécie de PfEMP1 é expressa por hemácia infectada (exclusão alélica transcripcional) - A expressão das PfEMPs varia em torno de 2% por ciclo sangüíneo

48 Aspectos clínicos: A malária Sintomas da infecção com Plasmodium spec. em pessoas não-imunes febre cefaléia sudorese artralgia mialgia calafrios frequente: febre intermitente as vezes: esplenomegalia diarréia, vômitos anemia

49 Somente em infecções com P. falciparum: devido a: grande acúmulo de substâncias tóxicas, citoaderência de hemácias infectadas, tendo como consequência suboxigenação de determinados orgãos Malaria grave: - malaria cerebral - anemia grave - insuficiência renal - síndrome pulmonar - Malaria gestacional

50 Markell´s and Voge´s Medical Parasitology

51 Diagnose da malária -> Detecção e discriminação de formas sangüíneas - Esfregaço de sangue, corado com corante Giemsa (quando tem muitos parasitas: >0,1% parasitemia) - Gota espessa, corado com Giemsa (quando tem poucos parasitas, <0,1% parasitemia) - QBC (quantitative buffy coat) - “Dip stick” tests, detectam antígenos maláricos circulantes (no campo): Histidin rich protein

52 Técnica de QBC Luz UV

53 P. vivax P. falciparum A identificação da espécie de Plasmodium em sangue de infectados requer treinamento de microscopistas

54 Terapia da Malaria O diagnóstico da espécie infectante é essêncial! O tratamento deve ser supervisionado SEMPRE por um médico. É necessário considerar quais estágios devem ser combatidos (Hipnozoítas, gametócitos, trofozoitas) Trofozoitas : Quinina, Cloroquina, Mefloquina, Halofantrin, Pyrimethamin, Tetraciclina, Doxiciclina, Artemisinina e derivados Estágios hepáticos: Primaquina, Proguanil, Tetraciclinas Gametócitos : Primaquina, Cloroquina, Amodiaquina Terapia de P. vivax : Cloroquina plus Primaquina Terapia de P. falciparum : Quinina + Tetraciclina ou Artemisinina + Amodiaquina Artemisinina + Lumefantrina (Coartem) Cloroquina não exerce mais nenhum efeito contra P. falciparum

55 “Balas de prata” perdidas para terapia de P. falciparum - Fansidar (pirimetamina + sulfadoxina) - Cloroquina Terapéuticos com relatos de função parcial - Mefloquina, quinina, amodiaquina, primaquina...(todos os lugares) - Artemisinina (Venezuela, Cambodia)

56 Novas drogas derivados de Vitamin B (“suicide drugs”) Inibidores da síntese de lipídeos Outras drogas que inibem a síntese de poliprenóides Atualmente existem poucas drogas contra as quais não existe alguma resistência Cloroquina foi perdida para terapia de P. falciparum Resistências variadas contra diversas drogas complicam o tratamento (follow-up necessário)

57 Profilaxia - Quimoprofilaxia é possível mas deve ser limitada a casos emergenciais (pessoas splenoectomizadas) - Usar repelente quando possível, uso de mosquiteiros impregnados com piretroides -Uso de luvas no tratamento cirúrgico de maláricos -Teste de contaminação de conservas em bancos de sangue - tratar os assintomáticos - Medidas ambientais - tratar igarapés com óleo (larvacido), ou criar tilápias para combater procriação de anofelinos - desmatar o terreno ao redor de moradias

58 from Good & Doolan 1998 Vacinas contra Malária

59 Vacinas contra Malaria - Esporozoítas irradiadas (imunidade estéril) Revés: formas sangüíneas parecem interferir com esta resposta protetora, curta duração, logisticamente difícil - vacinas recombinantes baseadas em antígenos do esporozoita e merozoita (anti-pre-eritrocítico e anti-formas sangüineas) Revés: Mutações e recombinações podem levar a escape imunológico, variantes locais - vacinas contra antígenos dos gametas ou gametócitos (anti-transmissão) (- vacinas anti-aderentes contra formas graves da infecção com P. falciparum?) - Esporozoítas transgênicos que não se desenvolvem para formas sanguíneas

60 90% dos casos de malária acontecem na área subsaariana e a maioria de de mortes são de crianças com menos de 5 anos Novas aproximações são perseguidas - Genoma de P. falciparum, Anopheles gambiae e Homo sapiens publicado em Transcriptoma e proteoma de P. falciparum em cultivo publicado em plasmodb.org: vários proteomas, transcriptomas, genomas - Uma politica eficiente para África onde morre a maioria das pessoas infectadas é urgente

61 Literatura: Markell´s & Voge´s Medical Parasitology L. Rey: Parasitologia Diversos Reviews ao longo dos anos em Trends in Parasitology, Nature, Science

62 Perguntas / Take home message Qual forma infecta naturalmente o hospedeiro intermediário e por qual via? Como o parasita (merozoita) consegue sair da célula hepática infectada sem ser fagocitado por células Kupffer (macrófagos)? Por que não podemos ver formas maduras do parasita sanguíneo em sangue de pessoas infectadas com P. falciparum ? Por que é necessário tomar primaquina ou tafenoquina quando infectado com P. vivax ? O que é necessário para desencadear uma epidemia de malaria?

63 Toxoplasmose e Toxoplasma gondii

64 O parasita:Toxoplasma gondii Parasita intracelular obrigatório, capaz de infectar diversos tipos de tecidos e hospedeiros. Descoberto em 1908 por Nicolle e Manceaux em um roedor do Norte da África denominado “gundi“. Em 1923 a transmissão congenital foi descrita, e um teste diagnóstico estabelecido por Albert Sabin e Henry Feldmann, comprovou que a infecção com T. gondii é muito comum Em 1956 foi postulado que a infecção seria por ingestão de carne crua infectada com cistos, comprovado em O ciclo de vida completo foi descoberto somente em 1970.

65 Filo Apicomplexa Classe Sporozoa Subclasse Coccidia Ordem Eucoccidiida Família Sarcocystidae Apicoplasto

66 Cisto tecidual

67 Genoma de 80 Mb distribuido em vários cromossomos de 2-6 Mb, organismo predominantemente haploide. Genoma mitocondrial de 6 kb e do apicoplasto de 35 kb Geneticamente accessivel por transfecção de plasmídeos com diferentes marcadores de resistência, por isso as vezes utilizado como organismo modelo para Plasmodium Três cepas diferentes existem em circulação, somente cepa I é virulento em seres humanos

68 Ciclo de vida No ser humano existem tachizoitas e bradizoitas

69 A locomoção e invasão é ativa e depende de um “motor“ actina-miosina e proteinas parecidas com trombospondina na superfície (Opitz e Soldati, 2002)

70 A passagem de T. gondii por celulas não interfere com a viabilidade das células e não influi na infectividade do tachizoita ao contrário do que acontece com esporozoitas de Plasmodium

71 Dentro da célula hospedeira, o tachizoito se desenvolve dentro de um vacúolo parasitóforo com o qual não ocorre fusão com lisossomos

72 Interação parasita-hospedeiro: Como reage o hospedeiro ao parasita? MM IL12 NO OH. NK IFN  T 1. Resposta celular T (CD8+) IFN , IL2 PQ (Tromboxano)

73 2. Resposta humoral (Antígenos reconhecidos: SAG1, proteinas MIC etc.) IgG, IgM, IgA e IgE, complemento lisa tachizoitos na presença de anticorpos específicos

74 3. Controle de formas bradizoitos em cistos - O rompimento ou não da parede do cisto parece depender do nivel de IFN  e NO - No caso de imunossupressão bradizoitas se transformam em tachizoitos novamente! Mensageiro: Acido abscisico

75 A resposta é diferente em lugares diferentes Cerebro (dados de estudos em camundongos) Células T possivelmente se ligam a receptores endoteliais antes da extravasão Antigeno de parasitas é apresentado por células glia e celulas T são ativadas para secretar IFN  Microglia e astrócitos participam na destruição do parasita e de células infectadas

76 Olhos Normalmente, o liquido intra-ocular contém imunosupressores Tachizoitos e cistos são encontrados na neuroretina e no epitélio pigmentado da retina IFN  e TNF  plus NO parecem limitar a infecção ao menos no camundongo

77 Patogenia da infecção com Toxoplasma gondii Em imunocompetentes, infecção passa despercebida % dos pacientes podem desenvolver linfoadenopatia cervical e/ou um quadro semelhante a uma virose pela multiplicação do parasita (destruição de tecido e pequenas necroses), raramente ocorre hepatite, pneumonite e retinocoroidite. Sobram calcificações e bradicistos. A presença do parasita pode causar neuro-disturbios complexos, as vezes sutis – difícil de comprovar Em imuno-suprimidos (pacientes com transplantes, aidéticos), infecções latentes são reativadas e levam em 25-50% dos casos a encefalite (90% letal se não tratado), convulsões, efeitos neurologicos, as vezes miocardite.

78 Em fetos, pode ocorrer a disseminação desenfreada do parasita e destruição em massa de tecidos e calcificação. Sequelas do feto são no caso da primi- infecção de gravidas no primeiro trimestre (observados após o parto): morte/aborto 10% encefalite, hidrocefalite, microcefalite ou retinocoroidite e calcificações 30% não se infectam 50-60%

79 Patologia da infecção com Toxoplasma gondii hidrocefalo retinocoroidite Fase aguda Fase crônica Roberts & McLeod, Parasitology Today 1999

80 Diagnóstico - Diagnóstico clínico do adulto quase impossível - Diagnóstico no imunosuprimido e neonatal é sugestivo, mas tem que ser confirmado pela detecção do parasita 2. Parasitológico: a partir de material de biópsias - coloração com Giemsa - inoculação intraperitoneal ou intracerebral em camundongos suscetíveis (Balb/C), depois biópsias - inoculação de cultura de fibroblastos, formação de plaques após poucos dias 1. Clínico: sintomas

81 3. Imunológico/molecular - ELISA específico detectando IgG ou IgM em soro de pacientes - Imunofluorescência direta e indireta - Por PCR 4. Por exame neurológico - visualizando lesões cerebrais por tomografia computadorizada ou ressonância magnética

82 Epidemiologia Parasita quase perfeito: Aprox. 70% dos seres humanos tiveram contato com T. gondii Alta incidência em paises com hábitos de comer carne crua (infecção com bradicistos!): França 96%, Alemanha 70%, no Brasil, 50-80% (L. Rey) Gatos domésticos são uma fonte importante de oocistos: milhões de oocistos por gato infectado são eliminados diariamente! A infecção do gato pode durar até um ano. O oocisto mantém se viável por 1 a 1 ½ anos Esporadicamente ocorrem contaminações com oocistos pela água que podem levar a epidemias locais

83 7 dias mais tarde...

84 Precauções extraordinárias devem ser tomadas com mulheres grávidas ainda não infectadas Cozinhar/grelhar bem carne antes de comer Bradicistos são inativados em carne por congelamento de mais que três dias a –20°C Limitar a circulação de gatos a lugares ondem brincam crianças (caixa de areia!) Uso/troca frequente de luvas no atendimento Controle

85 Tratamento -Indicado somente para casos graves e mulheres grávidas, a infecção de adultos imuncompetentes não necessita terapia -O objetivo do tratamento é duplo: Eliminar o parasita Abrandar reações aversas da resposta imunológica para conter destruição de tecidos nobres

86 Tratamento clássico: Pirimetamina-Sulfadiazina - Dose inicial de 75 mg Pirimetamina, depois 25 mg per diem PLUS - Dose inicial de 2 g Sulfadiazina, depois 1 g per diem durante 4-6 semanas Alternativamente: Clindamicina 300 mg per diem plus sulfadiazina durante 4-6 semanas Alternativamente: Tetraciclina Dose inical 2 g, depois 250 mg plus sulfadiazina durante 4-6 semanas Todos tem efeitos colaterais, folato deve ser administrado para conter efeitos da Pirimetamina na medula óssea

87 Tratamento imunossupressivo - Esteroides/corticoides mg por dia após o começo da terapia com antibióticos - Não aplicar esteroides perioculares - NUNCA aplicar esteroides SEM terapia com antibióticos

88 Vacinas? Objetivo é: Inibir infecção inicial (IgA na mucosa intestinal) Inibir infecção geral (resposta celular Th1) Inibir infecção transplacentar (IgG) “Gold Standard“ e imunização com T. gondii cepa S48

89 GM Bhopale, 2003 Microbes and Infection

90 Leitura citada e recomendada: Internet: Artigos encontrados no PubMed procurando por: Toxoplasma gondii + vaccines Toxoplasma gondii + retinochoroiditis Toxoplasma gondii + pathology Livros: Luis Rey: Parasitologia Markell, John, Krotoski: Medical Parasitology

91 Citoaderência/intenso contato de hemácias infectadas em células dendríticas pode levar a anergia das mesmas DC Células T (CD8 + ) específicas para peptídeos plasmodiais apresentados em MHC1 de células hepáticas são inibidas por estas células dendríticas


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