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Terapia Génica: da produção de modelos animais de doença ao tratamento Luís Pereira de Almeida Departamento.

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1 Terapia Génica: da produção de modelos animais de doença ao tratamento Luís Pereira de Almeida Departamento de Vectores e Terapia Génica Head: Mª Conceição Pedroso de Lima Encontro de Ciência em Portugal Fundação Calouste Gulbenkian Lisboa, 12 e 13 de Abril de 2007

2 Vectores virais Transplantação de células Células encapsuladas Bombas osmóticas Aebischer and Ridet TINs; 2000 Sistemas poliméricos Terapia génica ex vivo Terapia génica in vivo Estratégias de administração para o sistema nervoso central LPAlmeida

3 Transferência de genes com vectores lentivirais Célula alvo LTR GAG PROPOL VIF VPRVPUNEF LTR ENV TAT REV HIV-1 PGK GAG RRE SA SD LTR SIN TransgeneWHV Genoma do vector Terceira geração - Seguros Sem capacidade de replicação Transdução de células que não se dividem Neurotropismo Expressão prolongada Ausência de resposta imunitária LPAlmeida

4 Medula espinal estriado SN a células com o gene de interesse Transferência de genes para diferentes regiões do sistema nervoso central do rato LPAlmeida

5 Doença de Huntington transcrição Huntingtina - 350kDa tradução NH 2 >40 Doença de Huntington (CAG)n huntingtin gene 8-29 normal - 67 exões kb - cromossoma 4 Gene da Huntingtina Movimentos involuntários descoordenados, demencia, depressão, psicose morte anos após manifestação Sem terapia Modelos transgénicos com neurodegeneração, quando existente, muito ligeira Neurónios Gabaérgicos striatum LPAlmeida

6 Gene mutado Promotor 5 LTR 3 LTR Gene da doença 1 vector lentiviral 4 Modelos animais Injecção no cérebro 3 2 Produção de vectores lentivirais - Doença de Huntington - Doença de Machado-Joseph - Doença de Parkinson - Doença de Alzheimer Vectores lentivirais para produzir modelos animais de doenças neurodegenerativas LPAlmeida

7 Vectores controlo Produção de um modelo da doença de Huntington utilizando vectores lentivirais 0.5mm Agregados de huntingtina Lesão neuronal Huntingtina mutante 82 Q transgene Vectores Huntintina mutante Vectores Huntingtina mutante 50 µm 100 µm Huntingtina controlo 19 Q Ausência de agregados de huntingtina Ausência de lesão neuronal Injecção estereotáxica no cérebro do rato LPAlmeida

8 Novos modelos genéticos Transponíveis para outras espécies Estudo dos mecanismos moleculares da doença in vivo Avaliação de terapias Utilização de vectores lentivirais para produzir modelos animais de doenças neurodegenerativas

9 Ataxia espinocerebelosa do tipo 3 ou doença de Machado Joseph Doença neurodegenerativa Maior incidência em Portugal (Ilha das Flores) Principal sintoma: ataxia - descoordenação dos movimentos musculares voluntários Taroni F & DiDonato Nat Rev Neurosci Aug;5(8): gene SCA3/MJD1 (CAG)n n= normal n= 61 a 84 doença Ataxina 3 transcrição translação -14q32.1 NH 2 gene da ataxina-3 42 kDa LPAlmeida

10 AGCAGCAGCGGGACCTATC shAtax mut T T C A A A G A G TCGTCGTCGCCCTGGATAG AGCAGCAGGGGGACCTATC shAtax wt T T C A A A G A G TCGTCGTCCCCCTGGATAG Nova estratégia para o tratamento da doença de Machado-Joseph silenciamento da expressão da ataxina-3 mutante com vectores lentivirais Ataxina mutante + sequencias controlo Ataxina mutante + sequências para silenciamento ataxina-3 mutante

11 1H9DARPP-32 Dupla marcação 1H9DARPP-32 3 semanas Neuroprotecção mediada pelos lentivirus que silenciam a produção da ataxina mutante Ausência de agregados e de perda de DARPP-32 Agregados de Ataxina-3 perda de IR-DARPP-32 Ataxina-3 mutante + sequencias controlo Ataxina-3 mutante + sequências para silenciamento ataxina-3 mutante LPAlmeida

12 Vectores lentivirais: plataforma tecnológica de administração no Sistema Nervoso Central Gerar novos modelos animais de doenças do Sistema Nervoso Central Validar alvos terapêuticos Terapia génica para o Sistema Nervoso Central Terapia/validação de alvos moleculares Modelos de doença LPAlmeida

13 Agradecimentos MIRCen Nicole Déglon Philippe Hantraye Emmanuel Brouillet Raymonde Hassig Nöelle Dufour Patrick Aebischer Ruth Luthi-Carter Étienne Regulier Philippe Colin Valérie Perrin Veronica Colomer Johns Hopkins School of Medicine, USA Sebastian Kugler Gottingen University, DE Sandro Alves Isabel Ferreira Ana Luísa Carvalho Conceição Pedroso Lima Sérgio Simões João Nuno Moreira

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22 1H9DARPP-32 Dupla marcação 1H9DARPP-32 3 semanas Neuroprotecção mediada pelos lentivirus que silenciam a produção da ataxina mutante Ausência de agregados e de perda de DARPP-32 Agregados de Ataxina-3 perda de IR-DARPP-32 Ataxina-3 mutante + sequencias controlo Ataxina-3 mutante + sequências para silenciamento ataxina-3 mutante LPAlmeida

23 Vectores lentivirais que expressam RNAs curtos de cadeia dupla permitem silenciar a expressão da ataxina-3 mutante envolvida na doença de Machado-Joseph- potencial interesse terapêutico

24 Vectores controlo Vectores Huntingtina mutante de Almeida et al. (2002) J. Neurosci. 22: Lentiviral-based Model of Huntingtons disease in adult rats 0.5mm 50 µm 100 µm Agregados de huntingtina Lesão neuronal Huntingtina mutante 82 Q transgene Huntingtina controlo 19 Q transgene


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