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TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA EM PLANTAS Luciano da Silva Pinto Doutorando em Biotecnologia

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Apresentação em tema: "TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA EM PLANTAS Luciano da Silva Pinto Doutorando em Biotecnologia"— Transcrição da apresentação:

1 TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA EM PLANTAS Luciano da Silva Pinto Doutorando em Biotecnologia

2 Definição É a introdução controlada de ácidos nucléicos em um genoma receptor, excluindo-se a introdução por fecundação

3 Usos da Transformação de Plantas A. Testar a função de genes ou partes de genes B. Modificar a expressão de genes endógenos –Desligar genes –Aumentar a expressão –Modificar a expressão C. Mover genes entre organismos.

4 Aplicações Resistência a insetos: uso de inibidores de proteinases, toxinas bacterianas (gene Bt )-Milho, algodão, batata e soja Tolerância a herbicidas: Soja Roundup Ready, Milho, Cana-de-açúcar e Eucalipto Resistência a vírus: os gene da capa protéica ou capsídeo do próprio vírus foi introduzido na planta, funcionando assim como uma espécie de "vacina". Alteração de coloração de flores: envolvidos de rotas bioquímicas

5 Alteração da qualidade nutricional: Empresa Calgene obteve óleos ricos e ácido esteárico, um ácido graxo saturado, arroz que produz beta- caroteno, precursor de vitamina Produção de vacinas: Batata, tabaco, banana e alface. PLANTICORPOS - Cuba

6 Possíveis Impactos no Meio Ambiente Fluxo gênico: transgene população silvestre Poluição genética ou contaminação gênica de espécies silvestres Cultivos próximos de parentes silvestres Cevada, alface, arroz, aveia, batata, sorgo e trigo Reações alérgicas ou de hipersensibilidade Reações de intolerância – alterações fisiológicas, como reações metabólicas anormais e toxicidade

7 Etapas da Produção de Plantas Transgênicas - Identificação e isolamento do gene; - transferência do gene; - seleção das células que contenham o gene transferido; - regeneração de plantas; - expressão do gene nas plantas adultas.

8 Isolamento de genes Busca de genes de interesse em bancos de dados; Construção de primers e amplificação por PCR; Quantificação e sequenciamento. TGTGAACACACGTGTGGATTGG...

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10 Cassete de Expressão = região promotora = região terminadora

11 Promotores e terminadores mais utilizados Promotores constitutivos – CaMV 35S : 35S do vírus do mosaico da couve-flor –pNOS: Nopalina Sintetase do pTiC58 de A. tumefaciens Promotores Orgão/ tecido específico – Vicilina, glutenina: específicos para expressão em sementes –pPATATIN : tubérculos de batata – RuBisCo: tecido clorofilado –pLECTINA: expressão em sementes de feijão Promotores induzidos –phsp70 : "Heat shock gene" de milho Terminadores 3'OCS: Octopina sintetase do pTiB6S3; 3'NOS:Nopalina sintetase do pTiC58; 3'G7 : Gene 7 do pTiAch5

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15 Estratégias mais utilizadas de transferência de DNA para plantas Vetor biológico: Agrobacterium (uma bactéria do solo com duas espécies importantes: A. tumefaciens e A. rhizogenes) Vetores virais: O CaMV permite inserções de no máximo 0.8 Kb. POUCO USADO Plantas intactas - Bombardeamento com micropartículas, de ouro ou tungstênio (com cerca de 1 μm de diâmetro) Transferência direta: De protoplastos - A membrana celular é permeabilizada por choques eléctricos ou agentes permeabilizantes (como o polietilenoglicol) – eletroporação

16 Transformação via vetor natural Agrobacterium tumefaciens rhizogenes Transferência natural de DNA para plantas

17 Plasmídio Ti

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19 1) injuriada e liberação de compostos fenólicos pela célula vegetal; 2) ligação de Agrobacterium à superfície da célula, mediada por proteínas bacterianas e vegetais; 3) interação de composto fenólico com a proteína VirA; 4) fosforilação da proteína VirG; 5) ativação da transcrição dos genes de virulência (genes vir); 6) formação da fita-T, ligada à proteína VirD2; 7) produção da proteína VirE2; 8) organização do complexo-T (fita-T, VirD2 e VirE2); 9) transferência do complexo-T para a célula vegetal; 10) entrada do complexo-T no núcleo celular; 11) integração do T-DNA ao genoma celular. (modificado de Sheng & Citovsky,1996). Representação esquemática da interação Agrobacterium-planta

20 Representação esquemática de um plasmídeo Ti/Ri e da estratégia usada para a transferência de genes no sistema de transformação via Agrobacterium com vetor binário pTi, plasmídeo indutor de tumor de A. tumefaciens; pRi, plasmídeo indutor de rizogênese de A. rhizogenes; Região vir, região de virulência; Região-T, região (DNA) transferida; BD, borda direita da região-T; BE, borda esquerda da região-T.

21 Genótipo-específico (planta - bactéria) AGROBACTERIUM - Desvantagens Monocot X Dicot Dependência do sistema de regeneração

22 MÉTODOS DIRETOS DE TRANSFORMAÇÃO Dois grupos: aqueles que se utilizam de células desprovidas de parede celular (protoplastos) e aqueles que possibilitam a transformação de células intactas ou tecidos. Em ambos métodos, o gene de interesse juntamente com o marcador seletivo e/ou repórter são transferidos como constituintes de um pequeno plasmídio de E. coli.

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24 Obtenção de protoplastos Um protoplasto é uma célula "nua": perdeu a parede, mantém a membrana e adquire aspecto circular. A perda da parede celular é conseguida pelo uso de enzimas capazes de a degradar (ex.: celulase).

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26 MICROINJEÇÃO

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28 Biobalística Equipamento Processo Micro partículas de ouro

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30 Vantagens Diversos protocolos de cultura de tecidos Não exige vetores especializados Transformação de organelas Rapidez e simplicidade Desvantagens Equipamento especializado Integração múltipla de transgenes Variabilidade do processo

31 Genes de seleção de transformantes Genes marcadores para resistência a antibiótico. Os mais utilizados são: Gene neo: isolado do traposon Tn5 de Escherichia Coli, codifica para a enzima neomicina fosfotransferase II (NPT II). Resistência a canamicina Gene hpt: codifica para a enzima higromicina fosfotransferase (HPT) foi isolado de Escherichia coli e confere resistência ao antibiótico higromicina. Gene csrl: codifica para uma forma alterada da enzima sintase do ácido acetohidroxil (AHAS), também conhecida como acetato sintase (ALS). Gene aroA: foi isolado de Salmonela tyhimurium tratada com mutagênico e selecionada para a resistência ao herbicida glifosato. Gene bar: clonado de Streptomyces hygroscopicus, codifica para a enzima fosfinotricina acetiltransferase (PAT), que inativa o herbicida fosfinonotricina (PPT). Resistência a algum herbicida. Os mais utilizados são:

32 GENES REPÓRTERES genes nos e ocs: foram isolados do T-DNA de Agrobactérium e codificam para a síntese da neopalina (NOS) e para a síntese de octopina (OCS), respectivamente. Gene lacZ: foi isolado de Eschirichia coli e codifica para a B- galactosidase, más é pouca usado em plantas porque estas possuem uma alta atividade endógena de B-galactosidase, de difícil quantificação. Gene cat: codifica a enzima clorafenicol acetiltransferase (CAT), que não é encontrada normalmente em plantas. Bastante usado em plantas, apesar da utilização de radioatividade. Gene neo: O NPT II usado também como gene marcador de seleção. Gene luc: codifica para luciferase de Photinus pyralis e tem sido usado como gene repórter em plantas. Gene uidA: este gene foi isolado de Escherichia coli e é o gene repórter mais utilizado atualmente. Ele codifica para a B- glucuronidase GUS. Gene gfp: foi isolado de Aequorea victória (medusa) e codifica para a grenn fluorescent protein (GFP).

33 Epicótilo alongado cocultura Formação pró-gemasMultiformação de pró-gemas Multibrotação

34 Gene uidA

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36 Tipos de transgênicos

37 Primeira geração – Características agronômicas São aqueles que já existem no mercado mundial, obtidos com o objetivo de melhorar características agronômicas como a resistência a insetos e doenças e a tolerância a herbicidas. Estes produtos, na maioria dos casos trazem muitos benefícios ao produtor, como por exemplo: –aumento de produtividade; –diminuição de custos de produção, por meio da redução do uso de defensivos agrícolas e combustível; –melhoria da qualidade do produto final, com menores índices de fungos e micotoxinas;

38 Segunda geração – Qualidade alimentar São aqueles que já estão sendo pesquisados e incluem os alimentos com maior qualidade (maior teor de nutrientes por exemplo) e que trazem benefícios também ao consumidor, tais como: –Alimentos com maior teor de proteínas e minerais (como o ferro); –Óleos com teores mais elevados de ácidos graxos do tipo ômega 3 (mais saudáveis).

39 Terceira geração – Produtos especiais Ainda em fase de desenvolvimento, são os produtos de utilização farmacêutica (vacinas, hormônios, proteínas humanas, biorretores) e industrial (plásticos biodegradáveis e lubrificantes).

40 Alguns exemplos de plantas geneticamente modificadas -Tomate longa vida Flavr Savr, produzido pela companhia norte-americana Calgene, com o objetivo de obter frutos com maior conservação. Este tomate transgênico foi o primeiro produto liberado comercialmente para consumo nos Estados Unidos, em Tomate com maior teor de licopeno, pigmento que dá a cor avermelhada ao fruto, é uma substancia antioxidante, que atua no organismo contra vários tipos câncer.

41 Arroz dourado, contendo alta concentração de pró-vitamina A. A proeza, realizada por pesquisadores da Suíça e Alemanha, foi possível pela introdução de três genes envolvidos na síntese de beta-caroteno (pigmento vegetal), encontrados em uma flor (o narciso-dos-prados), em plantas de arroz.

42 Arroz contendo maior concentração de ferro nos grãos, para uso na alimentação humana e animal.

43 Soja Roundup Ready (RR) da Monsanto, resistente ao herbicida glifosato. Esta soja traz benefícios ao produtor, pois reduz a aplicação de herbicidas e mão-de-obra, elimina as plantas competidoras, resultando num aumento de produtividade.

44 Milho e algodão Bt, resistentes a insetos (certo tipo de lagarta). Estas plantas contém um gene proveniente da bactéria Bacillus thuringiensis, muito comum na natureza, e há muitas décadas usada como inseticida natural, principalmente na agricultura orgânica. Os principais benefícios ao agricultor são a redução do uso de inseticidas, o aumento da produtividade e a qualidade do produto final.

45 Tomate transgênico com altas doses de antioxidantes protegem contra o câncer Tomate com mais licopeno, Vacinas,

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48 Produtos em desenvolvimento Quanto aos produtos que estão sendo pesquisados e desenvolvidos no Brasil, ainda em caráter experimental, tem-se: –milho com maior teor de metionina no grão (EMBRAPA); –melão com maior potencial de conservação (UFPEL); –feijão resistente ao vírus do mosaico dourado (EMBRAPA/CENARGEN); –laranja resistente ao cancro cítrico (IAPAR); –batata resistente ao vírus do mosaico PVY (EMBRAPA Hortaliças, CENARGEN e UFPEL); –soja brasileira resistente ao herbicida glifosato (Roundup) (EMBRAPA Trigo); –mamão resistente ao vírus da mancha anelar (EMBRAPA/CENARGEN), o qual foi recentemente liberado pelo Ministério do meio Ambiente para avaliação a campo.

49 A área plantada com transgênicos cresceu 12% em 2007, com valores globais chegando a 700 milhões de dólares. Área global histórica de cultivos transgênicos

50 Área global de cultivos transgênicos por característica genética Cultivos com duas ou mais características genéticas transgênicas e são se tornando cada vez mais populares, ganhando daquelas variedades que mostram apenas resistência a insetos.

51 Experimentos em campo com cultivos transgênicos na Europa O número de experimentos em campo com transgênicos na União Européia aumentou discretamente (fonte: European Union, GMO Compass).

52 Em 2007 o Brasil ultrapassou os EUA em novas áreas de plantio. A Índia continuou seu rápido crescimento, seguida de perto pelo Paraguai, África do Sul e Uruguai. Em oposição, na Austrália as áreas com cultivos transgênicos continuam em queda. Área global de plantios transgênicos no mundo, por país.

53 Principais culturas A vasta maioria do milho, da soja e de algodão plantado nos EUA é transgênico.

54 Empresas envolvidas na transformação genética de plantas

55 Produtos produzidos em plantas

56 PGMs em testes Herbicidas Alfafa Algodão Batata Beterraba Canola Chicória Linho Milho Morango Soja Tabaco Trigo Insetos Alfafa Algodão Batata Batata-doce Beringela Café Cana Canola Milho Soja Vírus Abóbora Arroz Batata Beringela Mamão Melão Petúnia Soja Tomate Tabaco Qualidade Banana Batata Café Canola Cravo Crisântemo Kiwi Soja Tomate

57 Nem tudo são Flores p3?base=./biotecnologia/index.html&conteudo =./biotecnologia/artigos/royal.html php3?base=./biotecnologia/index.html&conte udo=./biotecnologia/artigos/sementes.html Relatório britânico condena as sementes transgênicas Onde está a prova de que os alimentos transgênicos são, por natureza, inseguros?, pergunta a Royal Society

58 Limitações Silenciamento de genes Especificidade de promotores Número de cópias Efeito posicional Presença de genes marcadores Diferenças entre espécies/genótipos


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