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Controle epigenético da expressão gênica em plantas Alteração da expressão gênica sem alterações na sequência de DNA Caso clássico: Alterações epigenéticas.

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Apresentação em tema: "Controle epigenético da expressão gênica em plantas Alteração da expressão gênica sem alterações na sequência de DNA Caso clássico: Alterações epigenéticas."— Transcrição da apresentação:

1 Controle epigenético da expressão gênica em plantas Alteração da expressão gênica sem alterações na sequência de DNA Caso clássico: Alterações epigenéticas que afetam propriedades de pigmentação Duas possibilidades: permanecem após a meiose x não permanecem após a meiose Mudancas epigenenéticas típicas das plantas: normalmente transmitidas na meiose

2 Mecanismos da variação epigenética: Metilação do DNA Mudanças no posicionamento do nucleossoma Mudanças no empacotamento dos nucleossomas Metilação: mecanismos para garantir a heranca mitótica ou meiótica de padrões específicos de metilação. DNA-metil transferase; preferência pelo motivo CpG ou Cp Modificações covalentes do nucleossoma Metilação: mecanismo mais connhecido

3 1) : ATPase tipo SNF2 (Lsh) aflouxa os contatos entre o DNA e as histonas 2) Metiltransf. da histona (Suv39H1) metila Lys hist. (estrela): Configuração da cromatina permissível à metilação 3) Targeting factor reconhece a sequência a ser metilada, e traz consigo os fatores para a metilação: DNMT1: citosina-5-metil transferase HDAC: desacetilase da histona MeCP2: proteína de ligação ao DNA metilado 4) Sin3a +HDAC: desacetilação das histonas resultando em sua condensação

4 Metilação e repressão transcricional

5 Imprinting: a expressão de certos alelos difere dependendo da origem do gameta Exs: mamiferos, fungos e plantas Bom nível de expressão quando transmitido pelo óvulo ::cor sólida da semente Ex: pigmentação da semente de milho: alelos r (red): Baixo nível de expressão quando transmitido pelo pólem ::cor variegada: Mecanismo epigenético 1: Imprinting Diferenças fenotípicas: não depende da dosagem do gene R mas sim de mudanças epigenéticas que são macho-específicas

6 2x x 2x Imprinting: sementes; mudanças epigenéticas relacionadas a dosagem gênica e ligadas ao sexo Transgênicos e Mutantes hipometilados Grande desenvolvimento do endosperma periférico e chalazal, mas sem celularização Fenocópia 4x x 2x Fenocópia 2x x 4xFenocópia 2x x 6x Maternalização = redução da metilação Reduzido endosperma periférico e chalazal

7 Fatores epigenéticos controlando o desenvolvimento da semente paternal

8 Mecanismo do imprinting (ratos) Dois genes reciprocamente sofrendo imprinting: 90 kb distância Igf2: fator cresc. fetal H19: RNA sem prot. DMD: differentially methylated domain -> silenciador: papel no desliga expressão H19 e IGF2 Bloqueia o estimulador de Igf2 Estimuladores Endoderme Mesoderma Específico para mesoderme ?

9 Interação alélica: a expressão de um alelo em um heterozigoto é alterada na presenca de outro; herdável através da meiose Alelo B(booster): B-I: pigmentacao forte; B: pigmentacao fraca B-I: mesmo gene: heterozigoto transmite somente o alelo B B: transcrição vezes menor Alelo Pl; forte pigmentação das anteras; Pl: cor variegada PI e P: mesmo gene: heterozigoto transmite somente o alelo P Mecanismo epigenético 2: Paramutação

10 DNA metilado: proteínas ligam-se ao DNA metilado Mecanismo da paramutação; Mecanismo 1 Interação dos cromossomas Mecanismo 2 formação da heterocromatina Promotor 1 Promotor 2 RNA aberrante Sinal difusivel: RNA enzimas modificadoras das histonas fatores remodeladores da cromatina Transferência direta de elementos da cromatina

11 Citosinas metiladas podem ser mantidas na replicação Mutantes com alterações no mecanismo epigenético da regulação gênica Milho: mop1: mediator of paramutation 1: bloqueia a paramutação do gene B e de outros pigmentos ambos genes PAI tornam-se então metilados Arabidopsis: o caso dos genes PAI: sintese triptofano: 2 genes, em 2 cromos. PAI: Phosphoribosilanathranilate isomerase Introdução de novos genes PAI não metilados tornam-se metilados

12 Estratégia de seleção de mutações que afetam as mudancas epigenéticas em PAI metilacoes Planta transgênica utilizado na seleção genética 1 0 mutante isolado 2 0 mutante isolado metilação redução na fluorescência Nivel de metilação = reostato controle do nível de expressão gênica intermediário fluorescente Reação catalizada pela enzima PAITriptofano ………. Única sequência PAI que pode ser expressa no cromossoma 1 foi mutada Met1 e CMT3: codificam para duas diferentes metil-transferases deDNA [ ]X

13 Mecanismo epigenético 3: Silenciamento Detecção: plantas trangênicas; Arabidopsis, Petunia e tabaco Repetição da presença de genes :::: silenciamento de outras sequências Estrutura ou organização do cromossoma como causa do silenciamento Petunia mutata : sem cor (sem o gene A1): Adição da segunda cópia de A1: transcrição silenciada: herdável geneticamente Gene silenciado A1 pode induzir silenciamento epigenético de outro gene A1 novo, somente quando esse gene A1 expresso é inserido próximo do primeiro. Variegação: Silenciamento da segunda cópia Introdução gene A1 do milho: cópia simples: Flor torna-se pigmentada

14 Mecanismos: TGA (transcriptional gene silencing) pela metilação PTGA (post-transcriptional gene silencing) pela metilação: não afeta a transcrição ddm1: afeta o reconhecimento da metilação met1: afeta a metilação mom1: TGS independente da metilação

15 Mecanismo epigenético 3: Silenciamento: Co-supressão Transgene pode induzir o silenciamento de um gene endógeno e homólogo Experiência da sobre-expressão da chalcone sintase Co-supressão não herdável geneticamente: atividade endógena é restabelecida quando ocorre a segregação do transgene Silenciamento de viróides: enxerto de planta contaminada por um vírus em outra planta contaminada com outro vírus:. Silenciamento de outro vírus: Transmissão do sinal por toda a planta: Efeito a nível pós-transcripcional Silenciamento não-herdável

16 Autopoliploidia; oportunidade para alterar a expressão gênica (silenciamento), e criar um tampão contra o efeito de mutações deletérias Vantagens dos alopoliplóides: manter a natureza híbrida indefinidamente Mudanças durante o estabelecimento da um autopoliplóide: eliminação de sequências de DNA, expansão heterocromatina, Silenciamento nos alopoliplóides: metilação: uso do aza-dC Autopoliploide Duplicação gênica Duplicação gênica Híbrido F1 Alopoliplóide Diferencas no número de cormossomas ou organização Inicio da formação de um poliplóide: choque: podem romper o pareamento e distribuição : duplicação dos cromossomas- silenciamento genes duplicados; - reduzir infidelidade cromossomal translocacao recíproca de segmentos de cromossomas: ajudam diferenciar os cromossomas homólogos dos homeologos Eventos epigenéticos na poliploidização (70% angiosperma; 95% pteridófitas)

17 Modelo explicativo do silenciamento em poliplóides

18 Causas potencias da origem da variabilidade em poliplóides

19 Seleção de mutações que afetam o controle das alterações epigenéticas ddm1: mutação no gene (SNW/SNF2) : fator de remodelação da cromatina; Mamíferos mudanças na estrutura da cromatina devem anteceder a metilação Sem fenótipo visível; autofecundação: reduzido nível de metilação :: nova metilação e silenciamento de genes que são normalmente expressos e não metilados (SUPERMAN): flores anormais Problema para a obtenção de plantas transgênicas: - súbito silenciamento do transgenes 1 a defesa para superar este problema: selecionar planta transgênica com cópia unica Plantas antisenso para MET1; redução em 30% no nível de metilação Hipermetilação do gene SUPERMAN Hipermetilação do gene SUPERMAN e do gene AG progenia anormal::desestabilização da programação epigenética Paradoxo?

20 Genes do florescimento precoce: genes silenciadores: mecanismos epigéneticos no controle do florescimento (repressores epigeneticos) Genes do florescimento precoce: genes de proteinas associadas a cromatina Repressores epigenéticos

21 Mutantes tfl2, emf : 1) florescem precocemente, 35S:TFL1 4 sépalas nova influorescência 35S:EMF1 + DL duas folhas caulinares flor terminal (2 silíquas) novo broto terminal 35S:EMF1 + DC flores e brotos originados na mesma regiao Importância da remodelagem da cromatina no controle da expressão gênica e dos processos de desenvolvimento Pouco compeendido como esses fatores de remodelagem da cromatina funcionam em plantas 2) florescem sob DC, flor terminal, 3) proteínas de reserva da semente são expressas antes

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23 PGTS (post-transcriptional gene silencing):primeiramente descoberto em plantas Primeiro gene regulatório para PGTS foi descoberto em Neurospora PGTS: um poderoso meio para manipular a expressao em sistemas animais::RNAi PGTS: mais conhecido em Drosophila e levedura (Saccharomyces) Plantas usam as mudancas epigenéticas para se adaptar a mudancas genômicas ou ambientais::flexibilidade Flexibilidade: reprogramação dos estágios de desenvolvimento Mediado por moléculas de RNA pequenas (<70 nucleotídeos) Funções: 1) proteção contra efeitos deletérios da transposição de transposons 2) Resistência contra viroses (Produzem dsRNA)

24 DICER Pode ser transmitido entre células e a longas distâncias PGTS (Silenciamento pós-transc.

25 Comprimento médio de 25 nucleotídeos Tamanho médio de 70 nucleotídeos Dupla fita Fita simples Perfeitamente complementar ao RNA alvo Parcialmente complementar ao RNA alvo Direciona a clivagem endonucleolítica Mecanismo de ação desconhecido Inibe a tradução do mRNA RNA dupla fita perfeitamente ou quase perfeitamente pareado RNA dupla fita pareado, mas com alças Não conservado entre as espécies Frequentemente conservado entre as espécies e filos Altamente conservado entre as espécies e filos Cromossomal ou citoplásmico Cromossomal (IGR) RNA curto de interferência (siRNA ) RNA curto temporal (stRNA) Micro RNA (miRNA) Originado de um RNA percursor de maior tamanho

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27 Mecanismos pelos quais os microRNAs promovem o silenciamento

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29 RNAse tipo III Complexo de endonucleases

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31 Locus de controle do cruzamento sexual em S. pombe (mat2P) Metilação da histona Recrutamento: criação de um sítio de nucleação da heterocromatina Difusão do processo de diferenciação da heterocromatina: Silenciamento do locus mat2P

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33 Dicer Det. Da especificade de RISC: mutantes: arquit. mod 61 alvos potenciais: 41 são fatores transcricionais Dif. Merist. Axilar e da folha Separação de orgãos Identidade floral Desen. floral

34 TRV: tobacco rattle virus TRV-00: vírus sem inserto TRV-P: contendo 359 nt 3 da GFP TRV-35S: 347 nt do promotor da GFP Luz UV Nuclear Run of: taxa de transcrição Inoculação com o virus da planta transgênica 35SGFP PTGS PGS

35 Efeito da proteína HC-Pro no silenciamento sistêmico HC-Pro: proteína viral que suprime o silenciamento SilGUS: locus de silenciamento de GUS Silenciamento sistêmico Supressão do silenciamento sistêmico

36 RNAi: poderosa ferramenta atFAD2: Desaturase de A. thaliana

37 AttP1/AttP2: clonagem por Recombinação utilizando o sistema Gateway Amplifico o gene adicionando o sítios attB1 e attB2 Recombinação in vitro utilizando o sistema Gateway Gene orientação Senso substitui ccdB Gene orientação anti-senso substitui ccdB Sistema ccdB: proteína letal: sistema para a seleção do vetor recombinante

38 RNAi

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