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Programa de Pós-Graduação em Genética/UFMG Estudos de domínios reguladores de transcrição de proteínas Tead com novas tecnologias genéticas Erica Maria.

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1 Programa de Pós-Graduação em Genética/UFMG Estudos de domínios reguladores de transcrição de proteínas Tead com novas tecnologias genéticas Erica Maria de Queiroz Orientador: José Miguel Ortega Laboratório de Biodados, Biologia Celular e Desenvolvimento

2 Introdução As proteínas Tead domínio TEA (90% conservado) estrutura 3D homologia:camundongos (Tead1, 2, 3, 4) galináceos (TEF-1A, B, C e D) Drosophila (SD) Aspergilus nidulans (Aba A) leveduras (TEC-1)

3 Introdução 4 parálogos (camundongos): expressão estágios embrionários: pré-implantação/ final adulto Proteínas mTead:Função no desenvolvimento: mTead1 (, e )coração/ músculo mTead2neurônios/ rins mTead3placenta/ músculo/ coração / pulmões/ rins/ intestino mTead4 (4a e 4b)pulmões/músculo esquelético

4 Introdução especificidade de ativação e repressão de diferentes genes interações com outras proteínas Proteínas:Função:Referências: YAP65 co-ativador transcricionalDePamphilis et al., 2001 Max fosfoproteína nuclearGupta et al., 1997 TBP proteína de ligação a TATA boxJiang et al., 1996 TONDU/hVgl-1, hVgl-2 e hVgl-3 co-ativadores transcricionais Vaudin et al., 1999 MEF2 fator de transcrição de soroStewart et al., 2002 SRF fator de transcrição de miócitoGupta et al., 2001 PARP modificador de histonasOrdahl et al., 1999 P160 (SRC1,TIF2 e RAC3) co-ativadores nuclearesParker et al., 2000

5 Introdução A proteína mTead1 99% de homologia a Tead1 humana domínios caracterizados PROMOTOR 52 NAD TEA +++ PRSTYZF PROMOTOR Rodrigues, 2001

6 Objetivo Geral Desenvolver e aplicar tecnologias genéticas para o estudo de domínios reguladores da transcrição gênica utilizando proteínas Tead como modelo

7 Objetivos Específicos Verificar a existência de homologia funcional entre os domínios das proteínas mTead Isolar mutantes de mTead1: N-terminal N-terminal + TEA Desenvolver metodologia de seleção com o Sistema de Duplo-Híbrido em meio líquido Triagem de uma biblioteca de cDNA de embrião de camundongo de 7 dias utilizando PR e ZF como isca Aplicar nova tecnologia de análise de alteração da proliferação celular para verificar a atuação de mTead4 na regulação do ciclo celular Objetivos Específicos Verificar a existência de homologia funcional entre os domínios das proteínas mTead Isolar mutantes de mTead1: N-terminal N-terminal + TEA Desenvolver metodologia de seleção com o Sistema de Duplo-Híbrido em meio líquido

8 Metodologia de seleção com o Sistema de Duplo-Híbrido em meio líquido

9 Sistema de Duplo-Híbrido mRNA Gene Repórter HIS3 UAS Gal Proteína 1 DL Proteína 2 DA

10 Interações detectadas com o sistema de Duplo-Híbrido Proteínas:Referências: SNF1 / SNF4Fields et al., 1989 Proteínas cinases de SNF1Yang et al., 1992 SRF / SAP1Dalton et al., 1992 RAP1 / RIF 1Hardy, 1992 C-jun / c-fosKatoet al., 1992 Maize B / maize C1Goff et al., 1992 HIV gag / ciclofilina A e BLuban et al., 1993 Max / Mxi 1Zervos et al., 1993 Rb / proteína fosfatase tipo 1Durfee et al., 1993 Ras / Rafvan Aelst et al., 1993 p53 / antígeno-TLi & Fields, 1993 Grb2 / Sos1Chardin et al., 1993 várias proteínas hélice-alça-héliceStandinger et al., 1993 DBF4 / CDC7Jackson, 1993

11 Seleção em Meio Líquido Modelo Deepwell Modelo Erlenmayer A Proposta

12 Transformação em Leveduras Seleção 0, células/ml Inóculo 10 8 células/ml Transformação com LiAc trp leu Seleção em meio líquido não transformantes transformantes duplo-híbrido positivo -trp –leu -his 3AT-trp -leu n X 10 4 transformantes <1 duplo-híbrido Seleção em meio sólido

13 Seleção em Meio Líquido: Elaborando o Protocolo

14 Metodologia Elaborando o protocolo p53 GBD Gal4DL-p53 (1 g) GAD + Gal4DA (1 g) Adição de Gal4DA-largeT –0 ng –0,1 ng –1 ng –10 ng –100 ng largeT GAD Adição de Gal4DA-largeT –0 ng –0,1 ng –1 ng –10 ng –100 ng

15 Metodologia Os 4 experimentos -trp –leu -trp –leu -his -trp –leu –his 0,1mM 3AT -trp –leu –his 0,5mM 3AT Transformação 1:101:100OD (1+1+1) 1:101:100OD (2+1+1) (3+1+1) 1:101:100OD (2+1+2) 1:101:100OD dia 1dia 2dia 3dia 4dia 5

16 Resultados Preliminares

17 00,50,844,5119,3 transformantes em placa

18 Resultados Preliminares 00,50,844,5119,3 transformantes em placa

19 Resultados Preliminares 00,50,844,5119,3 transformantes em placa

20 Resultados Preliminares 00,50,844,5119,3 transformantes em placa

21 Sumarizando O protocolo OD =600 nm 5° dia Diluição 1:100 4° dia ON 30°C Diluição 1:10 3° dia ON 30°C Transformação 1° dia

22 Seleção em Meio Líquido: Modificando o Protocolo

23 Metodologia Modelo Deepwell 10,9 ml –trp –leu -his 1 ng 0 ng5 ng10 ng Transformações Gal4DL-p53 Gal4DA 100 ng Gal4DA-largeT Gal4DL-p53 Gal4DA 4,36 l21,8 l43,8 l Gal4DL-p53 Gal4DA 100 ng Gal4DA-largeT 436 l Gal4DL-p53 Gal4DA

24 Metodologia Modelo Deepwell Gal4DA-largeT Gal4DL-p53 (1 g) + Gal4DA (1 g) 0 ng 1 ng 5 ng 10 ng controle 4 placas grandes = 1 deepwell

25 [pTD1] (ng) Resultados Preliminares Modelo Deepwell % poços com crescimento % 22 setores em placas

26 pGBT9, pVA3, pVA3* + pTD1 - p53 p53 mut Perspectivas Modelo Erlenmayer transformação, diluições com seleção em 3- aminotriazol 1 pVA3 : 3 pVA3*enriquecimento pVA3

27 Perspectivas p53 p53 mut amplicon Construção GBD-p53GBD-p53 mut GBD Proteína p53p53 mut - Interação fortefraca não

28 Isolamento de mutantes do domínio N-terminal de mTead1

29 Sistema de Mono-Híbrido Reverso mRNA CAN1 / LacZ UAS Gal Proteína GBD MORTE / AZUL

30 100% 0,2% [L-can] domínio ativador? GBD?? plasmídio compete? Não = GBD Sim = domínio ativador Sobrevivência Starling, 2000 Sistema L-can Domínio ativador GBD

31 Ensaio de Competição contra Gal4p inteira Gal4p mais expressa = cor azul pCL1 (Gal4p) + Competidor (contém GBD) Co-transformação (repórter LacZ) GBD competidor mais expresso = Leveduras brancas (domínio ativador mutado, GBD não) Gene Repórter LacZ UAS Gal Proteína GBD GAD GBD X Gal4p

32 62%80%29% Relação entre plasmídio competidor X pCL1 (Gal4p) e porcentagem de colônias azuis em ensaio com X-gal Gonçalves, 2003

33 Metodologia Sistema de Mono-Híbrido Reverso Gene repórter = transportador de L-arginina/L-canavanina (tóxica) A seleção -w -ura Transformação YJOZ canR ON 30°C colônia individual N-terminal mTead1/4 GBD 10 5 células/ml meio seletivo L-canavanina

34 Obrigada!


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