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Elizabeth dos Reis Mazoni Andrade Orientadora: Dra. Mônica Bucciarelli Rodriguez Belo Horizonte Departamento de Biologia Geral Instituto de Ciências Biológicas.

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1 Elizabeth dos Reis Mazoni Andrade Orientadora: Dra. Mônica Bucciarelli Rodriguez Belo Horizonte Departamento de Biologia Geral Instituto de Ciências Biológicas 2002 PREPARAÇÃO DE UM SISTEMA PARA TRIAGEM DE PROMOTORES UTILIZANDO GENES REPÓRTERES DE PROTEÍNAS FLUORESCENTES EM Saccharomyces cerevisiae

2 LEVEDURAS Sequenciamento completo Investigação da Expressão Gênica Métodos para Análise da Expressão Gênica Microarranjos de DNA Exposição diferenciada Análise Seriada da Expressão Gênica Genes Repórteres

3 Promotores transcritos por RNA polimerase II: Estrutura de promotores Elementos básicos: PIC (TATA box), Inr, DPE Elementos regulatórios: UAS, URS, poly(dA-dT) HSF POL II HSP82 TATAAA HSE1 HSE2 HSE3 TFIIF TBP TFIIA TFIIB TFIIE TAFs PROMOTORES

4 Fusão transcricional Gene Repórter Promotor FUSÃO GÊNICA Fusão traducional Gene RepórterPromotor Met

5 GENES REPÓRTERES Beta-galactosidase LacZ Escherichia coli

6 Aequorea victoria GFP EGFP Ser-65 THr Phe-64 Leu yEGFP Otimização de códons

7 Discosoma sp. DsRed

8 tTAtransativator 7 Tet0 box lacZ TRP1 Ap r pCM bp tet0 7 CYC TATAlacZ tetR VP16ad SISTEMA REGULADO POR TETRACICLINA Promotor tetO-CYC1/tetR-VP16/lacZ

9 tetR VP16ad tet0 7 CYC TATAlacZ tetR VP16ad SISTEMA SEM TETRACICLINA

10 tetR VP16ad tet0 7 CYC TATAlacZ Tetraciclina SISTEMA COM TETRACICLINA

11 Sistema de triagem de promotores em Saccharomyces cerevisiae

12 Vetor para a biblioteca

13 Avaliação da meia vida de genes repórteres Sistema regulado por tetraciclina Caracterização dos Genes Repórteres

14 Determinação da meia vida da expressão de lacZ

15 Fase exponencial de crescimento Fase estacionária de crescimento

16 Fase exponencial de crescimento Fase estacionária de crescimento

17 Avaliação do efeito do bloqueio da tradução sobre a atividade proteolítica

18 Fase exponencial de crescimento Fase estacionária de crescimento

19 Avaliação da meia vida da expressão de proteínas fluorescentes

20 Construção dos plasmídios com as proteínas fluorescentes DsRed pCM173-DsRed EGFP pCM173-EGFP yEGFP pCM173-yEGFP y

21 DsRed

22 EGFP

23 yEGFP

24 Número de células fluorescentes de acordo com a fase de crescimento da levedura

25 Avaliação da expressão de lacZ utilizando MUG como substrato

26 Fase estacionáriaFase exponencial

27 Aspectos da utilização de genes de proteínas fluorescentes como repórteres para a triagem de promotores

28 ESTABILIDADEMATURAÇÃO

29 Visualização da produção de beta-galactosidase de acordo com o tempo

30 Número de células Número de células viáveis Unidades de beta-gal Experimentos utilizando meio SD Experimentos utilizando meio SD drop-out

31 CONCLUSÕES

32 O uso do sistema promotor tet0-CYC1/ativador tetR-VP16/gene repórter lacZ para visualização da meia vida da expressão de um gene repórter em Saccharomyces cerevisiae se mostrou viável para beta-galactosidase e pode ser utilizado para basicamente qualquer proteína em levedura. A utilização do sistema de bloqueio geral da tradução para visualização da meia vida de um gene repórter em Saccharomyces cerevisiae fornece um resultado mais longo que o real, devido ao bloqueio da tradução de proteínas proteolíticas. O uso de repórteres para triagem de promotores em diferentes fases de crescimento da levedura deve levar em conta que a meia vida do fenótipo é diferente. Existe uma regulação, durante as fases de crescimento da levedura, do sistema promotor tet0-CYC1/ativador tetR-VP16/gene repórter A presença de atividade detectável do gene repórter em apenas uma parcela das células albergando o sistema promotor tet0-CYC1/ativador tetR-VP16/gene repórter, é uma característica própria deste sistema

33 AGRADECIMENTOS


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