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Avaliação da diversidade microbiana Amostragem, processamento e técnicas.

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1 Avaliação da diversidade microbiana Amostragem, processamento e técnicas

2 Dificuldades na avaliação: Falta de recursos humanos capacitados Falta de financiamento Amplitude da diversidade Erosão da diversidade Falta de metodologias Porquê avaliar? Assegurar que microrganismos desempenhem processos necessários a produtividade e sustentabilidade. Assegurar que pelo menos alguns microrganismos sejam tolerantes a estresses.

3 Amostragem Processamento Detecção e avaliação – técnicas: i. Fenotípicas ii. Moleculares iii. Imunológicas

4 Etapa crítica São usados equipamentos especializados Devem ser considerados os seguintes fatores: - Representatividade - Não alterar os números e as atividades - Evitar a introdução de contaminantes - Estocar em condições adequadas

5 Uso de amostras compostas para minimização do erro Determinação do número mínimo de amostras Estatística determinará os limites de confiança Problema da representatividade

6 Estratégias de amostragem Acesso - direto Número de microrganismos - Baixo Equipamentos Processamento - Concentração em filtros Ar é um meio restritivo para os microrganismos (1) (1) Apesar de restritivo transmite inúmeros agentes patogênicos Amostragem no

7 Microbiota do ar Morte dos microrganismos no ar: dN/dt = -k.N ou ln (N/No) = -k.t k - coeficiente de inativação (velocidade específica de morte) Depende do tipo de microrganismo e das condições ambientais Fatores ambientais: Umidade relativa Temperatura Radiação (pigmentação, reparo do DNA) Radicais de O 2 Íons, dentre outros

8 Os microrganismos alcançam o ar através dos aerossóis Depende do tipo de microrganismo, partículas e fase gasosa

9 Amostragem do ar 2.Simulação respiratória (tamanho partícula 0,8 – 15 μm; velocidade do ar) 3. Colisão - Captura em líquido. Ex: AG Impacto - deposição em superfícies sólidas. Ex: coletor de Andersen 4. Centrifugação 5. Filtração 6. Deposição - Coleta passiva

10 Amostrador de Andersen

11

12 Simulação respiratória

13 Placas após incubação Ágar Sangue Ágar Dextrose

14 Impacto em líquido: AG-30

15 Equipamentos para amostragem do ar: Amostragem passiva Apenas microrganismos que caem nas placas Amostragem ativa Recuperação forçada usando um volume determinado

16 Método usado nas estações espaciais (Dados NASA)

17 Importância Aeromicrobiologia extramuro: Dispersão de patógenos e toxinas (botulínica, estafilocócica, LPS) Fitopatógenos (ferrugem) Doenças pulmonares e gastro-intestinais de animais Despejo de resíduos (sólidos e líquidos) Guerra biológica Aeromicrobiologia intramuro: Edificios (doenças dos Legionários-Legionella pneumophila, bactéria aquática disseminada pelos aparelhos de ar condicionado e água potável) Viagens de avião Saúde pública - gripes

18 Acesso - Direto ou remoto Números - elevados ou baixos Equipamentos - Recipientes, filtros Processamento - diluição ou concentração Amostragem na Depende nível de matéria orgânica

19 Equipamentos ROV (Veículo operado de forma remota) usados nas águas hidrotermais (Yellowstone Park) Águas termais são difíceis de amostrar convencionalmente Mensageiro controlado remotamente abre o recipiente para não ocorrer contaminação com microrganismos de outras profundidades

20 Acesso - Remoto Número de microrganismos - elevado Equipamentos - observatórios, sondas Processamento - diluição Amostragem em

21 Microbiota dos sedimentos Cowen, 2004 Observatórios penetrando 300 m nos sedimentos e crostas Um método efetivo de acesso ao sedimento enterrado é através de observatórios.

22 Baixa abundância (biomassa), porém microrganismos sempre presentes. Uso de sondas fluorescentes específicas para rRNA de Archaea e Bacteria e C radioativo para detectar atividade na crosta basáltica oceânica. Fisk et al., 1998 Ventarolas marinhas

23 Sedimentos: Elevada diversidade de Bacteria e Archaea 180 reações metabólicas envolvendo N, S e C inorgânico, metais e minerais assim como compostos orgânicos Diversos micro-nichos existentes

24 Acesso - direto Números de microrganismos - elevado ou baixo Equipamentos - trados, pás Processamento - diluição Amostragem no

25 SOLO Uma simples pá de solo de jardim contém mais espécies de organismos do que pode ser encontrado em toda a floresta Amazônica.

26 Problemas solo Distribuição dos microrganismos em agrupamentos Bactérias existem em hot-spots 1-5 g solo Elevada variabilidade entre amostras Estatística Dois fatores são críticos na escolha de um hot-spot: A existência de espécies endêmicas (restritas a um ecossistema específico )e grandes taxas de destruição do habitat.

27 SOLO Solo propriamente dito Elevada população devido a riqueza nutricional da rizosfera. BIOMASSA /g Características: 1. Micro colônias (interação ativa dentro das populações) 2. Populações com elevadas velocidades crescimento 3. Modificações ambientais 4. Troca genética Elevada diversidade governada pela Lei do Mínimo de Liebig. Subsolo BIOMASSA /g Distribuição não homogênea

28 Alguns números sobre a estrutura do solo

29 Microrganismos no solo Em cada grama solo tipicamente franco 2,8 X 10 5 m 2 - dimensões continentais para microrganismos > 1X células viáveis > 4 X10 3 espécies << 0,1% são cultivadas in vitro Maioria dos grupos são conhecidos apenas por informações de sequenciamento de DNA Apenas 1 ou 2 membros cultivados pertencem a ordens conhecidas Maioria diversidade é desconhecida!

30 Bactérias: 10 6 a 10 9/ g solo Bacilos Gram % Bacilos Gram + 2-7% Actinomicetos: 11-32% Arthrobacter, etc., 31-46% Algas: 10 1 x 10 6 g -1 Fungos: 10 4 a 10 6 g -1 Protozoários : 10 4 a 10 5 g -1 Bacteriófagos: ? % Culturabilidade por grupo: 0,8 a 7 % Números de microrganismos no solo :

31 Macrofauna e flora são relativamente fáceis de identificar e expressar usando riqueza específica e outros índices. Mas no solo as estimativas da diversidade da microbiota: Envolvem dificuldades: heterogeneidade, grupos difíceis de cultivar em meio de cultura Estratégias FAME (ésteres metílicos de ácidos graxos) CHO (carboidratos) Técnicas moleculares usando PCR Sorologia Solo

32 Populações /g Importantes patogênicos para homem Amostragem no

33 Cerca de 40 % água consumida pelo homem provem do fontes subterrâneas Existem gradientes nestas regiões: Forçado - quando água é movimentada em elevadas quantidades produzindo a movimentação dos microrganismos Passivo - natural sem influência artificial Vírus, bactérias e protozoários tem diferentes dimensões, metabolismos, mecanismos de sobrevivência e mecanismos de transporte diferenciados. Estudo da diversidade da microbiota da subsuperficie é muito complexa. Doenças causadas aumentou 40 % nos últimos 10 anos

34 Microbiota do subsolo Pesquisada na última década (dificuldades de amostragem) Inúmeros aeróbios oligotróficos: /g Análise comunidades: Archaea e Bacteria (muitas BRS) Como vivem? Quimioautotróficos e Quimiolitotróficos Metanogênicas (CO 2 ) CH 4 Acetogênicas (HCO 3 - ) acetato Bactérias redutoras de sulfatos (BRS) (SO 4 -2 ) sulfídrico H 2 é gerado pelo FeO+H 2 O H 2 +FeO 2

35 Sedimentos profundos 1. Número de bactérias cultiváveis em sedimentos é de 1000 a x MENOR do que em solos superficiais. 2. Camadas areia-água apresentaram contagens e atividade mais elevadas, do que as camadas argilosas perto da superfície. 3. Profundidade não é necessariamente limitante ao crescimento e atividade. 4. Estudo enumerou coliformes, redutores de sulfato e metanogênicas: - Atividade anaeróbia medida pelo desaparecimento de lactato, formato e acetato e produção de metano e H 2 S. Sedimentos não incluem apenas anaeróbios, sendo inclusive de 100 a vezes menor do que os aeróbios. - Número de coliformes baixou drasticamente com a profundidade, mas ainda estão presentes.

36 Microbiota do subsolo A 3,4 Km abaixo da superfície Possibilidades: 1. Foram incorporados nos sedimentos durante a formação das rochas há milhões de anos e sobrevivem em condições nutricionais de dieta mínima. 2. Infiltraram com as águas subterrâneas a partir de águas de superfície (maioria das bactérias que ocorrem em rochas como basalto e granito) 3. Crescem lentamente a partir de fontes de energia inorgânicas fornecendo carbono orgânico para outros microrganismos na matriz rochosa (SLiME - Subsurface Lithautotrophic Microbial Ecosystems).

37 1-10 microrganismos /g de rocha (10 -9 /g de solo superficial rizosférico) Densidade das comunidades é desconhecida : - Metabolismo microbiano é lento (dificuldade distinguir viável de inviável) - Células inviáveis são fonte nutricional para células viáveis (baixo movimento de água e nutrientes) - Difícil reproduzir as condições das profundezas em laboratório - Recentemente 9000 estirpes do subsolo foram catalogadas. - Peso dos microrganismos subterrâneos pode ser equivalente aos da superfície. Subsolo

38 Interação microrganismos - macrorganismos Plantas - seiva, filosfera Animais - sangue, dentes Não destrutivas Amostras

39 Processamento Objetivo: recuperação ótima Concentração - centrifugação e passagem por filtros Diluição - diluições seriadas Problemas: Porosidade dos filtros Composição quimica Problemas: Composição do diluente Tempo de mistura Grau de agitação Microrganismos encontram-se em números inapropriados (elevados ou baixos) e em comunidades (diversas espécies) Enriquecimento

40 Seleção natural aplicada in vitro Para microrganismos que metabolizam uma determinada substância ou que ocorrem em baixas populações na amostra. Desenvolvidas por Beijerinck Cultura de enriquecimento consiste na promoção de condições favoráveis específicas para o crescimento de um tipo particular de microrganismo. Ex 1: para isolar um fixador de nitrogênio o meio de enriquecimento não poderá conter uma fonte de nitrogênio. Ex 2: bactéria que degrada naftaleno deve-se cultivar a amostra em um meio cuja única fonte de C é o naftaleno. Ex 3: coluna de Winogradsky - enriquecimento de quimiolitotróficos. Ex 4: Para isolar Bacillus formadores de esporos aquecer a cultura mista e plaquear.

41 Detecção dos microrganismos Métodos: Fenotípicos - baseadas no cultivo ou avaliação de certas propriedades do microrganismos Imunológicos - baseadas nas características imunológicas Moleculares - baseadas na constituição genotípica

42 Fenotípicos Métodos baratos e não requerem treinamento diferenciado Amplificação de sinal: Cultivo em meio de cultura Técnicas morosas Em alguns sistemas não são precisas Isolamento cultura pura identificação

43 Diluição seriada Plaqueamento Amplificação sinal fenotípico colônias

44 Ex: Geobacter metallireducens CH 3 COO - + 8Fe H 2 O 2HCO Fe H + Adicionar acetato como única fonte de C no meio de cultura permite a detecção de microrganismos que usam óxido de ferro como fonte de energia Cultivo Crescer microrganismos em laboratório com base em características fenotípicas. Detectar grupos que usam determinada substância ou fonte energética e que vivem em determinadas condições físico-químicas.

45 Corantes vitais e fluorescência Células vivas (verde) e mortas (vermelho) em uma cadeia de Streptococcus pyrogenes População mista de Micrococcus luteus e Bacillus cereus com células vivas (verde) e mortas. Corantes DAPI e vermelho Texas. Corantes ácidos de núcleo: DAPI e verde SYTOX. Células danificadas exibem fluorescência verde.

46 Perfil lipídico - FAME O princípio se baseia no conceito de que alguns microrganismos possuem composições típicas de ácidos graxos celulares, os quais podem ser comparados à composição típica de ácidos graxos das cepas usadas para criar a biblioteca. Após comparação, a identificação dos microrganismos desconhecidos são determinadas.

47 Perfil FAME (Fatty acids methyl ester analysis) 1.Existe grande variabilidade no perfil da composição e proporção de ácidos graxos (membranas). Perfil FAME = impressão de uma espécie 2. Usado no estudo da diversidade microbiana em sistemas de tratamento de esgoto, em solos contaminados e biofilmes de sistemas de distribuição de água.

48 Outras técnicas fenotípicas MARA - multiple antibiotic resistance activity ARA - antibiotic resistance analysis CSU - carbon source utilization Detecção de hospedeiros de vírus

49 Avaliação da abundância relativa EnumeraçãoBiomassa Atividade Contagem direta Contagem indireta

50 Contagem direta Lâmina Petroff-Hauser ao microscópio Fluorescência, anticorpos Vantagens: Não requerem separação do microrganismo. Fornecem estimativas elevadas Desvantagens: Não distingue entre viáveis e não viáveis. Não permite análises subsequentes

51 Lâminas para contagem direta

52 Contagem indireta Contagem em placasNMP Técnica de Diluição e plaqueamento

53 Diluições seriadas (resultado)

54 Enumeração NMP

55 NMP – número mais provável

56 Contagem indireta Vantagens: - Detecção de viáveis - Seletividade (uso de meios específicos) Desvantagens: - permite a contagem de alguns tipos - Ausência de não cultiváveis Bioluminescência: detecta ATP residual Impedância/condutância: microrganismos alteram a corrente elétrica.

57 Avaliação da biomassa Parâmetro importante porque avalia os recursos energéticos disponíveis para a comunidade. Expresso em g e pode-se converter em energia: 4,9 Kcal/g peso seco Baseia-se no fato de existir uma correlação direta entre a abundância de um microrganismo com alguma substância característica. Proteína Peptideoglicano Quitina LPS DNA Dentre outros Indireta DiretaFiltração Centrifução Pesagem

58 Avaliação da atividade Fotossíntese – taxa de produção primária Respiração - consumo de O 2 ou produção de CO 2 Potencial heterotrófico - taxa de absorção de substâncias marcadas com radioisótopos Atividade enzimática - lacase, celulase, nitrogenase, amilase

59 Viáveis mas não cultiváveis (VNC) < 1% dos microrganismos podem ser cultivados no laboratório usando técnicas convencionais de cultivo. Os microrganismos que não são cultiváveis, mas são viáveis, se denominam VNC e requerem técnicas apropriadas para sua detecção. Ex: Fungos micorrízicos vesículo-arbusculares.


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