Herminia Yohko Kanamura Coordenação dos Institutos de Pesquisa (CIP)

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1 DIAGNÓSTICO LABORATORTIAL DA ESQUISTOSSOMOSE: métodos, vantagens e limitações
Herminia Yohko Kanamura Coordenação dos Institutos de Pesquisa (CIP) Superintendência de Controle de Endemias (SUCEN) Universidade de Taubaté (UNITAU)

2 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA ESQUISTOSSOMOSE MANSÔNICA
PARASITOLÓGICO Sedimentação espontânea Ritchie (centrifugação formol-éter) fezes (ovos) Eclosão de miracídios Pesquisa do parasita Kato biópsia retal tecidos (ovos, vermes, larvas) biópsia hepática Fonte:CDC DPDx

3 (c) (b) (d) (e) (a) (f) Esquema do processamento das fezes através da sedimentação espontânea (método de Lutz ou método de Hoffman, Pons & Janer. Frasco contendo amostra fecal Tomar 2 a 4 gramas de fezes, colocar em frasco e desmanchar em água com um bastão de vidro ou madeira Coar a emulsão através de gaze ou de uma tela para dentro de um cálice cônico Completar o volume do cálice juntando mais água e misturando bem o conteúdo. Deixar sedimentar por uma hora ou mais; derramar o líquido sobrenadante e substituir por água limpa, ressuspendendo o sedimetno.Repetir a operação até que o sobrenadante fique claro Com uma pipeta Pasteur, retirar uma pequena amostra de sedimento do vértice do cálice, colocar sobre uma lâmina, cobrir com lamínula e examinar ao microscópio.

4 Esquema do processamento das fezes através do Sistema Coprotest®
(b) (g) (i) (e) (f) (h) Lâminas preparadas com alíquotas de 50L do material processado (vide item 2.1.3) 7mL 3mL (d) (c) 1mL Suspensão fecal (j) Esquema do processamento das fezes através do Sistema Coprotest® a) homogeneização do material fecal, que neste estudo foi realizada com o auxílio de agitador de tubo, por 20 segundos; b) transferência de 7mL da suspensão obtida para um tubo de centrífuga de 10mL; c) adição de 1 gota de detergente doméstico; d) adição de 3mL de acetato de etila comercial; e) homogeneização através de agitação manual vigorosa; f) centrifugação durante 2 minutos a 1500 rpm; g) descarte do sobrenadante e ressuspensão do sedimento a 7mL, com água destilada; h) nova centrifugação por 2 minutos a 1500 rpm e descarte do sobrenadante; i) ressuspensão do sedimento a 1mL, com água destilada (procedimento adotado para ajustar o volume da suspensão fecal das diferentes amostras) j) Preparo de lâminas para observação ao microscópio.

5 Esquema do processamento de amostras pelo método de Kato-Katz
(b) (c) (d) (e) Esquema do processamento de amostras pelo método de Kato-Katz a) Frasco contendo fezes: homogeneização do material fecal; b) Transferência de uma porção de fezes para uma folha de papel e tamisação em tela de 105 malhas por polegada quadrada, recolhendo o material tamisado com uma espátula limpa; c) Transferência das fezes tamisadas para um cartão perfurado disposto sobre uma lâmina de vidro, preenchendo todo o espaço (volume fecal correspondente a cerca de 0,045g); d) Retirada do cartão e encobrimento da alíquota de fezes com uma lamínula de celofane previamente embebida em solução glicerinada de verde malaquita; e) Inversão da lâmina sobre uma superfície lisa e compressão das fezes de forma a se obter um esfregaço uniforme com cerca de 22mm de diâmetro.

6 Ovos de Schistosoma mansoni
Schistosoma mansoni eggs in Kato-Katz preparations are easily identified on the basis of size, shape and presence of the lateral spine. S. mansoni eggs are large, measuring µm by µm, have a thin, transparent shell, a prominent lateral spine and contain a miracidium. Occasionally, the lateral spine may be hidden from view. Gentle tapping on the coverslip usually will reorient the egg exposing the spine to view. Viable eggs have the same appearance in faeces and in rectal biopsies.

7 Appearance of A. lumbricoides, T
Appearance of A. lumbricoides, T. trichuria and hookworm eggs in Kato-Katz preparations A. lumbricoides, fertile and infertile eggs with a T. trichuria egg in the middle. A. lumbricoides and T. trichuria eggs. Characteristic features of both are preserved in this preparation Normal and decorticated A. lumbricoides egg in a Kato-Katz preparation. Decorticated eggs may be slightly smaller than normal eggs due to the absence of the mamillated layer. A. lumbricoides and hookworm egg.

8 Diagnóstico laboratorial da esquistossomose
Ocorrência de variações nos resultados do exame parasitológico (Kato-Katz) em 6 pacientes com infecções baixas (menos de 100 ovos por grama de fezes) e teste sorológico positivo.

9 Reação de imunofluorescência ELISA Western blot
IMUNOLÓGICO Detecção de anticorpos Reação intradérmica (hipers.imediata) heterólogos - KLH Antigeno ovo homólogos cercária verme Soro - diferentes técnicas sorológicas Extrato Total Frações purificadas DNA recombinantes Diagnóstico laboratorial da esquistossomose Reação de imunofluorescência ELISA Western blot Detecção de antígenos circulantes no SORO CCA anticorpos monoclonais e policlonais CAA P na URINA

10 ALGUMAS APLICAÇÕES IMPORTANTES PARA OS MÉTODOS SOROLÓGICOS
Diagnóstico laboratorial da esquistossomose ALGUMAS APLICAÇÕES IMPORTANTES PARA OS MÉTODOS SOROLÓGICOS Diferenciar infecção aguda da crônica Verificar cura parasitológica Diferenciar infecção ativa da passada Inquéritos epidemiológicos Programa de Vigilância Epidemiológica

11 Dinâmica de resposta imune humoral
Diagnóstico laboratorial da esquistossomose Dinâmica de resposta imune humoral na esquistossomose

12 Reação de imunofluorescência para detecção de anticorpos IgM (RIF-IgM)
Antígeno: cortes de vermes fixados em solução de Rossman e incluídos em parafina Conjugado fluorescente: anticorpos anti-IgM marcados com isotiocianato de fluoresceína

13 Imunofluorescência Indireta
Adição do soro des-conhecido Incubação e lavagem Lâmina com Ag. fixado Adição do con-jugado anti-hu-mano, incubar e lavar Visualização ao microscópio

14 Reação de imunofluorescência indireta (RIF-IgM)
com soro de paciente com forma aguda da esquistossomose

15 Reação de imunofluorescência indireta (RIF-IgG)
Diagnóstico laboratorial da esquistossomose Reação de imunofluorescência indireta (RIF-IgG) com soro de paciente com forma aguda da esquistossomose

16 Reação de imunofluorescência indireta (RIF-IgG)
Diagnóstico laboratorial da esquistossomose Reação de imunofluorescência indireta (RIF-IgG) com soro de paciente com forma crônica da esquistossomose

17 Diagnóstico laboratorial da esquistossomose

18 RIF-IgM (cortes de vermes parafinados) PARA VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA E CONTROLE DA ESQUISTOSSOMOSE EM ÁREA DE BAIXA TRANSMISSÃO

19 Prevalência parasitológica (Kato-Katz) e sorológica (RIF-IgM) nas populações estudadas das diferentes regiões (dados do primeiro inquérito)

20 Número e porcentagem (%) de casos para cada combinação de resultados do teste sorológico (RIF-IgM), entre os indivíduos que submeteram amostras de sangue nos cinco inquéritos realizados, nas diferentes regiões estudadas.

21 Número e porcentagem (%) de casos para cada combinação de resultados do teste sorológico (RIF-IgM), entre os indivíduos que submeteram amostras de sangue nos cinco inquéritos realizados, nas diferentes regiões estudadas.

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23

24 Positividade (%) por método parasitológico (Kato-Katz) e sorológico (RIF-IgM), de acordo com a condição “tratamento anterior para esquistossomose” (população de Itariri, Vale do Ribeira)

25 ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)
Substrato incolor Substrato colorido

26 AVALIAÇÃO DE MÉTODO IMUNOENZIMÁTICO PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS IgM CONTRA ANTÍGENOS CIRCULANTES DE S. mansoni

27 Análise comparativa dos resultados obtidos pelo ELISA-IgM em relação aos outros testes

28 Análise dos dados preliminares com relação ao Projeto de Pesquisa em desenvolvimento no município de Holambra “Implantação de método imunoenzimático para detecção de anticorpos IgM contra antígenos circulantes do S. mansoni (ELISA-IgM), e avaliação para incorporação no programa de controle da esquistossomose em área de baixa endemicidade” Total de amostras séricas encaminhadas ao Instituto Adolfo Lutz = 93 Total de amostras já submetidas a IgM-RIF = 73 Total de amostras já submetidas a IgM-ELISA = 71 Positividade sorológica pela IgM-RIF = 35,6% (26/73) Casos positivos pelo Kato Katz: - 7 casos – com 9 lâminas (3 amostras x 3 lâminas) - 3 casos – com 3 lâminas (1 amostra x 3 lâminas) - 2 casos – com 2 lâminas (1 amostra x 2 lâminas)

29 Comparação de resultados entre IgM-RIF e IgM-ELISA Dados preliminares de Holambra
+ - IgM-RIF 21 5 26 8 37 45 29 42 71

30 Resultados das lâminas de Kato-Katz
Resultados Preliminares - Estudo em Holambra RIFI-IgM ELISA-IgM Resultados das lâminas de Kato-Katz Resultado A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 POS NEG 01 2+ + N 1 X 02 3+ 03 04 3 2 4 05 1+ 06 2~3+ 07 08 15 14 16 09

31 Resultados das lâminas de Kato-Katz
Resultados Preliminares - Estudo em Holambra continuação RIFI-IgM ELISA-IgM Resultados das lâminas de Kato-Katz Resultado A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 POS NEG 10 3~4+ + N 11 2+ 3 4 2 1 5 19 X 12 1+ neg 13 14 3+ 15 1~2 16 17 - 18 2~3

32 Freqüência de anticorpos anti-T. canis e anti-S
Freqüência de anticorpos anti-T.canis e anti-S.mansoni, de acordo com a faixa etária. Peruíbe - SP