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Seminário – DNA e Cromossomos - 02/07/2004 Apresentação: Gilka e Gustavo.

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1 Seminário – DNA e Cromossomos - 02/07/2004 Apresentação: Gilka e Gustavo

2 Distrofia Muscular Tipo I (DM1): Doença autossômica dominante ligada a expansão de repetições CTG na região 3 não traduzida do gene DMPK (DM protein kinase) Indivíduos normais: 5 a 37 repetições Indivíduos afetados: 50 a 5000 repetições Varias hipóteses são propostas para explicar o surgimento da doença

3 Expansão de regiões repetitivas: Replicação desigual do microssatélite: Nova Replicação: Célula Normal Célula Com Expansão Formação do grampo

4 Por que a expansão de CTG leva à distrofia miotônica?

5 Perguntas sobre o possível efeito da expansão: Transcrito funcional Cinase DM Só a cinase que sofre e ela teria efeito pleiotrópico? A expansão do gene tornaria a cromatina instável? Local da expansão x

6 Hipótese dos autores: RNA do gene mutante (expandido) se liga aos fatores básicos de transcrição (TFs), sequestrando-os dos locais de onde eles deveriam atuar.

7 Se mRNA mutante seqüestra alguns TFs seletivamente, deve haver um acúmulo dos TFs ligados ao mRNA mutante e não a outros mRNAs.

8 Experimento 1 Para testar a premissa anterior foi realizada uma imunoprecipitação de extratos nucleares com anticorpos contra: –NUP153 (proteína do complexo de poro) –CUG-BP1 (controle – alta afinidade pelo mutante) –PDGRF-â (proteína da membrana) –Sp1 (fator de transcrição) –Soro Seguida de RT-PCR do precipitado para verificar em qual destas proteínas o RNA mutante estava ligado e se outros RNAs estavam ligados a elas

9 Fatores de transcrição (TFs) ligam-se seletivamente ao RNA mutante em células DM1: Alelo selvagem Alelo mutante Para Sp1Para RARã

10 A depleção leva a uma redistribuição dos TFs dentro da célula afetada? CROMATINA mRNA mutante seqüestra os TFs RPN

11 Experimento 2: Extração do núcleo e separação dos componentes: –DNase I : isola fração da cromatina –RNase : isola fração do RNP Analise de western blot dos TFs (RARã, Sp1 e Sp3, STAT1 e STAT3) por 4,5 semanas para RARã e 3 semanas para os demais. Miócito Extrai o núcleo DNaseI Cromatina RNase RNP WESTERNBLOTWESTERNBLOT

12 Dinâmica da distribuição dos fatores de transcrição nos compartimentos nucleares em células normais e em células DM1 Células normais Células DM1 Western blot de RARã:

13 Redistribuição dos TFs (RARã, Sp e STAT) em células afetadas (DM1): Razão de RARã na cromatina/RNP em quatro linhagens após 4,5 semanas em cel. Normais e DM1: Para RARγ: Redistribuição dos TFs das famílias Sp e STAT após 3 semanas (por Western blot): Crom. RNP Resultado não convincente Repetir o procedimento com número fixo de células

14 Distribuição de RARã na cromatina durante o cultivo para um número fixo de células:

15 A retirada dos TFs dos seus locais específicos de atuação diminuiria a expressão dos genes dependentes desses fatores?

16 Experimento 3: Para medir os níveis de mRNAs dos genes escolhidos, realizou-se uma RT-PCR quatitativa, chamada análise de TaqMan: (Com quantos ciclos a reação chega a tantos mols de replicons?...). Além disso foi feita um Northern Blot de células antes da indução e depois da indução da expressão de DMPK

17 Northern Blot de mRNAs de genes específicos antes e depois da indução do gene DMPK:

18 Níveis relativos de mRNAs em células normais e DM1:

19 A expressão dos genes que codificam os TFs também é diminuída, levando a uma maior diminuição da expressão dos genes dependentes desses fatores. x mRNA TF Levando a: Baixa na transcrição de TFs Baixa na transcrição dos genes dependentes dos TFs

20 E a doença? O gene CLCN1 codifica CIC-1,que é um canal de cloro dos músculos esquéleticos,no qual sua alteração implica em uma Distrofia miotônica do tipo 1. Em células afetadas os níveis de mRNA deste gene é diminuído, devido provavelmente à diminuição de Sp1.

21 Será que é? Quando se restabelece o nível de Sp1 na célula afetada (via transdução), o nível de expressão de CLCN1 também é restabelecido?

22 Experimento 4: Foi feita uma transdução através de um plasmídio com alta expressão de Sp1 e Sp3 a fim de reabastecer a célula de Sp1para verificar se os níveis de expressão de CLCN1 aumentariam também.

23 Níveis de mRNA dos genes CLCN1 e FCGRT após expressão de TFs da família Sp:

24 Conclusões: Os resultados dos experimentos corroboram com a hipótese dos autores de explicação da relação entre a expansão de DMPK e o surgimento da distrofia miotônica do tipo I


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