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Introdução Este trabalho laboratorial foi realizado com o intuito de produzir, na bactéria E. Coli, a proteína Drg11 associada a dois tags diferentes:

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2 Introdução Este trabalho laboratorial foi realizado com o intuito de produzir, na bactéria E. Coli, a proteína Drg11 associada a dois tags diferentes: 6 Histidinas 6 Histidinas GST (Glutationa S-Transferase) GST (Glutationa S-Transferase)

3 Drg11 É uma proteína de regulação de 30KDa que funciona como factor de transcrição. É uma proteína de regulação de 30KDa que funciona como factor de transcrição. É importante no estabelecimento do circuito nociceptivo durante o desenvolvimento embrionário. É importante no estabelecimento do circuito nociceptivo durante o desenvolvimento embrionário. Pode estar envolvido na organização dos neurónios. Pode estar envolvido na organização dos neurónios.

4 Importância deste trabalho A expressão heteróloga de proteínas é muito importante quando se pretende proceder ao estudo funcional das mesmas. A expressão heteróloga de proteínas é muito importante quando se pretende proceder ao estudo funcional das mesmas. Em primeiro lugar, torna-se necessária a produção e purificação da proteína e, finalmente, a obtenção do anticorpo que lhe corresponde. Em primeiro lugar, torna-se necessária a produção e purificação da proteína e, finalmente, a obtenção do anticorpo que lhe corresponde.

5 As proteínas de fusão consistem na associação de duas proteínas (a Drg11 com um tag). As proteínas de fusão consistem na associação de duas proteínas (a Drg11 com um tag). A utilização de tags possibilita a purificação da proteína de interesse, através da cromatografia de afinidade, por intermédio do uso de resinas com determinados constituintes que apresentam afinidade para esses tags. A utilização de tags possibilita a purificação da proteína de interesse, através da cromatografia de afinidade, por intermédio do uso de resinas com determinados constituintes que apresentam afinidade para esses tags. His-Drg11: resina com Níquel His-Drg11: resina com Níquel GST-Drg11: resina com glutationa GST-Drg11: resina com glutationa

6 Os vectores de expressão utilizados são os plasmídeos: Os vectores de expressão utilizados são os plasmídeos: PGEX – contém o cDNA da proteína de fusão GST-Drg11. PGEX – contém o cDNA da proteína de fusão GST-Drg11. PRSETA – contém o cDNA da proteína de fusão His-Drg11. PRSETA – contém o cDNA da proteína de fusão His-Drg11. Utilizam-se dois vectores diferentes porque as proteínas de fusão podem ter comportamentos diferentes nas culturas de bactérias seleccionadas. Utilizam-se dois vectores diferentes porque as proteínas de fusão podem ter comportamentos diferentes nas culturas de bactérias seleccionadas.

7 E.Coli A estirpe de E.Coli utilizada foi a BL21. A estirpe de E.Coli utilizada foi a BL21. A BL21 é uma estirpe geneticamente modificada, caracterizada pela inactivação de muitos dos genes que codificam as suas proteases. Assim, a probabilidade de ocorrer a proteólise das proteínas de interesse é menor. A BL21 é uma estirpe geneticamente modificada, caracterizada pela inactivação de muitos dos genes que codificam as suas proteases. Assim, a probabilidade de ocorrer a proteólise das proteínas de interesse é menor.

8 Procedimentos Foram-nos fornecidos dois stocks de bactérias desta estirpe previamente submetidas a um processo de transformação com os dois plasmídeos recombinantes: PRSETA ( His-Drg11) PRSETA ( His-Drg11) PGEX (GST-Drg11) PGEX (GST-Drg11)

9 Drg11 PRSETA His 1KDa + 30KDa = 31KDa cDNA da Drg11

10 Drg11GST 26KDa + 30KDa = 56KDa PGEX cDNA da Drg11

11 Protocolo experimental 2 stocks de bactérias submetidas a um processo de transformação Repicou-se e colocou-se em LB/Ampicilina Rejuvenesceu-se (1/10 em LB/Ampicilina) Adicionou-se IPTG Overnight a 30ºC 2h30 Aguardou-se 4h para expressão das proteínas

12 O IPTG é um indutor da transcrição genética que aumenta a quantidade da enzima T7 RNA polimerase, a qual se liga ao promotor T7, iniciando a transcrição do cDNA de interesse. O IPTG é um indutor da transcrição genética que aumenta a quantidade da enzima T7 RNA polimerase, a qual se liga ao promotor T7, iniciando a transcrição do cDNA de interesse. Para cada conjunto de bactérias transformadas realizou-se um controlo e variou-se a concentração deste indutor, a fim de conhecer a concentração ideal a adicionar. Para cada conjunto de bactérias transformadas realizou-se um controlo e variou-se a concentração deste indutor, a fim de conhecer a concentração ideal a adicionar.

13 Sedimentou-se por centrifugação Aspirou-se o sobrenadante Colocou-se o pellet em gelo Adicionou-se uma mistura de lise Nonidet P40 Mg 2+ PBS DNAse Obteve-se um extracto de proteínas SDS-PAGE Corou-se com Azul de Coomassie

14 SDS-PAGE com amostras do extracto proteico da E. Coli transformada com o plasmídeo PRSETA (cDNA de His-Drg11) Clone 3 Clone 2 IPTG(mM) 2 1 0, ,5 0 KDa Uma banda de peso molecular de cerca de 100 KDa foi induzida. Pode representar a T7 RNA Polimerase. Uma banda de peso molecular de cerca de 100 KDa foi induzida. Pode representar a T7 RNA Polimerase. Na zona de peso molecular esperado (31 KDa) encontrou-se uma banda de 26 KDa. Na zona de peso molecular esperado (31 KDa) encontrou-se uma banda de 26 KDa.

15 SDS-PAGE com amostras do extracto proteico da E. Coli transformada com o plasmídeo PGEX (cDNA de GST-Drg11) Não se observou nenhuma banda de 56 KDa. Não se observou nenhuma banda de 56 KDa. Provavelmente não ocorreu indução. Provavelmente não ocorreu indução. Clone 2 Clone 1 IPTG(mM) 2 1 0, ,5 0 KDa

16 Aplicou-se a técnica imunoblotting: Repetiu-se o SDS-PAGE; Fez-se um Western blotting; Incubou-se com o anticorpo anti- Drg11 disponível. Aparentemente não houve indução da transcrição do cDNA responsável pela produção da GST- Drg11, no entanto parece ter havido expressão da His-Drg11. Para confirmar estas possibilidades:

17 Membrana de nitrocelulose do plasmídeo PRSETA (cDNA de His-Drg11) KDa 200 – 116 – 97 – 66 – 45 – 31 – 21 – Clone 2 Clone 3 0 0, ,5 1 2 IPTG(mM)

18 Membrana de nitrocelulose do plasmídeo PGEX (cDNA de GST-Drg11) Clone 1 Clone 2 0 0, ,5 1 2 IPTG(mM) KDa 200 – 116 – 97 – 66 – 45 – 31 – 21 –

19 Com bases nos resultados obtidos, conclui-se que não ocorreu a expressão das proteínas His-Drg11 e GST-Drg11. Com bases nos resultados obtidos, conclui-se que não ocorreu a expressão das proteínas His-Drg11 e GST-Drg11.

20 Razões para a falta de expressão da Drg11 Condições de indução: Condições de indução: Concentrações de IPTG insuficientes; Concentrações de IPTG insuficientes; Temperatura e tempo de indução inadequados. Temperatura e tempo de indução inadequados. As proteínas a obter podem ter tido um efeito tóxico nas bactérias utilizadas. As proteínas a obter podem ter tido um efeito tóxico nas bactérias utilizadas. Reconhecimento destas proteínas como sendo estranhas pelas bactérias e, consequente, proteólise das mesmas. Reconhecimento destas proteínas como sendo estranhas pelas bactérias e, consequente, proteólise das mesmas.

21 Sugestões para trabalhos futuros Selecção de outra estirpe de E. Coli; Selecção de outra estirpe de E. Coli; Utilização de um meio de cultura diferente; Utilização de um meio de cultura diferente; Variação das condições de indução; Variação das condições de indução; Fazer nova transformação bacteriana; Fazer nova transformação bacteriana; Tentativa de expressão destas proteínas por formas truncadas. Tentativa de expressão destas proteínas por formas truncadas.

22 Bibliografia Alberts B, Jonhson A; Lewis J; Raff M; Roberts K; Walter P. Molecular Biology of the Cell. 4ª edição, Garland Science, Cooper, GM. The cell, a molecular approach. 2ª edição, Sinauer Associates, Inc.,

23 Agradecimentos Serviço de Histologia e Embriologia Abel Salazar pelo espaço e material disponibilizado; Serviço de Histologia e Embriologia Abel Salazar pelo espaço e material disponibilizado; Professor Doutor Carlos Reguenga pela orientação facultada ao longo do trabalho; Professor Doutor Carlos Reguenga pela orientação facultada ao longo do trabalho; Professora Doutora Deolinda Lima pela oportunidade de realizar um trabalho laboratorial. Professora Doutora Deolinda Lima pela oportunidade de realizar um trabalho laboratorial.


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