Bioquímica para Enfermagem Prof. Dr. Didier Salmon MSc. Daniel Lima

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1 Bioquímica para Enfermagem Prof. Dr. Didier Salmon MSc. Daniel Lima
Glicólise Bioquímica para Enfermagem Prof. Dr. Didier Salmon MSc. Daniel Lima

2 Glicólise Oxidação da glicose a piruvato
O que acontece com a glicose que ingerimos?

3 Via Glicolítica Citossol
Glicólise (quebra da glicose) – via catabólica, transdução da energia presente na glicose em ATP e NADH 1 molécula de glicose é degradada em 10 reações enzimáticas a 2 moléculas de piruvato 10 Etapas catalisadas por enzimas livres no citossol Citossol

4 Pode ser dividida em fases
hexoquinase G0’ = - 16,7 kJ/mol fosfoglicose isomerase G0’ = + 1,7 kJ/mol Investimento de energia A glicose é fosforilada duas vezes e clivada para gerar duas moléculas de gliceraldeído-3-fosfato. fosfofrutoquinase-1 G0’ = - 14,2 kJ/mol Fase Preparatória (Gasto de ATP) – investimento de energia aldolase G0’ = + 23,8 kJ/mol triose fosfato isomerase G0’ = + 7,5 kJ/mol

5 Pode ser dividida em fases
gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase G0’ = + 6,3 kJ/mol fosfoglicerato quinase Recuperação de energia As duas moléculas de gliceraldeído-3-fosfato são convertidas em 2 moléculas de piruvato com a produção de 4 ATPs, tendo um saldo líquido de 2 ATPs. G0’ = - 18,8 kJ/mol fosfoglicerato mutase G0’ = + 4,4 kJ/mol Fase de pagamento: recuperação da energia investida com saldo positivo de 2 ATPs e 1 NADH enolase G0’ = + 7,5 kJ/mol piruvato quinase G0’ = - 31,4 kJ/mol

6 Delta G fisiológico diferente do delta G padrão

7 As Reações da Glicólise
1ª Etapa: Dupla fosforilação as custas de 2 ATPs Hexoquinase Hexoquinase - catalisa reação exergônica, irreversível nas condições celulares Fosforilação da Glicose no carbono 6

8 As Reações da Glicólise
Fosfoglicose isomerase Isomerização de uma aldose em uma cetose (glicose em frutose)

9 As Reações da Glicólise
Fosfofrutoquinase-1 (PFK1)

10 As Reações da Glicólise
2ª Etapa: clivagem da hexose produzindo 2 trioses fosforiladas, que são interconvertíveis Aldolase Reaction #4 is catalyzed by aldolase. It has a strongly positive Delta G zero prime. In the cell, however, the reaction is pulled by reactions ahead of it (which remove products) and pushed by reactions behind it (which increase amounts of reactants), making the Delta G favorable (negative). The products of this reaction are G3P and DHAP. Nas concentrações pequenas de reagentes a reação é reversível

11 Reação da Aldolase (Classe I)
Em aldolase de mamífero, os principais resíduos de aminoácidos envolvidos cataliticamente na reacção são a lisina e a tirosina. A tirosina actua como um aceitador eficiente de hidrogénio enquanto a lisina covalentemente liga-se e estabiliza os intermediários. Uma base de Schiff (ou azometina), nomeada após Hugo Schiff, é um grupo funcional que contém uma ligação dupla carbono-nitrogênio com o átomo de nitrogênio conectado a um grupo arila ou alquila mas não há hidrogênio

12 As Reações da Glicólise
Interconversão de trioses (Triose Fosfato Isomerase)

13 As Reações da Glicólise

14 As Reações da Glicólise
3ª etapa: oxidação e nova fosforilação das trioses fosfato (por Pi), formando 2 moléculas de 1 intermediário com 2 grupos fosfato Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase Reaction #6 is catalyzed by glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. It contains the only oxidation reaction of glycolysis. Electrons from G3P are donated to NAD+ to form NADH. Note that an additional phosphate group is added to G3P in this reaction to form 1,3BPG. The overall Delta G zero prime is slightly positive. The amount of NAD+ is critical for determining the direction of this reaction.

15 As Reações da Glicólise
A oxidação do carbono torna a entrada do Pi favorável ... Oxidação do aldeído (gliceraldeído 3-fosfato) a ácido carboxílico, com redução de NAD. Reação termodinamicamente favorável. 2 R – CO – H + 2 NAD+ + 2 H2O → 2 R – CO – OH + 2 NADH + 2 H+ 2. Ligação do Ác. Carboxílico com Pi, formando anidrido carboxílico-fosfórico, que é endergônica. 2R – CO – OH + 2 HPO4-2 → 2 R – CO – O – PO3-2 + H2O As reações ocorrem acopladas por um intermediário rico em energia. Reação pode ser inibida pelo arseniato que compete com o fosfato

16 Inibição de GAP desidrogenase
fosforólise Oxidação pelo NAD+ Inibição de GAP desidrogenase

17 As Reações da Glicólise
4ª etapa: transferência dos grupos fosfato para ADP, formando 4 ATPs e 2 piruvatos. Fosfoglicerato quinase Formação de ATP por transferência de fosforila Fosforilação ao nível do substrato!! Acoplamento das reações GAPDH e PGK: GAP + Pi + NAD+ → 1,3-BPG + NADH DG 0’ = +6.3 kJ/mol 1,3-BPG + ADP → 3PG + ATP DG 0’ = kJ/mol DG 0’ = kJ/mol

18 As Reações da Glicólise
Fosfoglicerato mutase

19 As Reações da Glicólise
Enolase Reação de desidratação

20 As Reações da Glicólise
Piruvato quinase Duas partes: ADP ataca a fosforila do PEP formando ATP e enolpiruvato - tautomerização do PEP a piruvato Acoplamento das reações: kJ/mol (hidrólise de PEP) suficiente para impulsionar a síntese do ATP.

21 Resumindo... A glicólise é uma via quase que universal, onde 1 molécula de glicose é oxidada a 2 moléculas de piruvato sendo a energia liberada conservada em 2 moléculas de ATP e 2 moléculas de NADH Todas as enzimas da via glicolítica são citoplasmáticas e seus intermediários são moléculas fosforiladas de 3 ou 6 átomos de carbono Na fase preparatória da glicólise, 2 moléculas de ATP são consumidas Na fase de pagamento da glicólise, há produção de 1 molécula de NADH e 2 moléculas ATP para cada triose.

22 Equação geral da glicólise
2 2 Glicose + 2ATP + 2NAD+ + 4ADP + 2Pi 2Piruvatos + 2ADP + 2NADH + H+ + 4ATP + H2O Glicose + 2NAD+ + 2ADP + 2Pi 2Piruvatos + 2NADH + H+ + 2ATP + H2O

23 De onde vem a glicose circulante?
Quebra do glicogênio, alimentação ou gliconeogênese Gliconeogênese

24 Digestão de Carboidratos
Inicia-se na boca a-amilase salivar: rompimento das ligações a(1→4) Amilopectina e glicogênio possuem ligações a(1→6), e sendo assim, o produto da digestão da a-amilase contém uma mistura de moléculas de oligossacarídeos menores e ramificados. Como adquirimos os carboidratos da dieta? Digestão inicia-se na boca (digestão do amido -> amilase salivar)

25 Digestão de Carboidratos
A digestão dos carboidratos cessa temporariamente no estômago, devido ao pH que inativa a a-amilase salivar O conteúdo gástrico é neutralizado pelo bicarbonato secretado pelo pâncreas, e a a-amilase pancreática continua o processo digestivo no intestino

26 Digestão de Carboidratos
A digestão final ocorre pela ação de enzimas da mucosa intestinal –dissacaridases e oligossacaridases Há a absorção de monossacarídeos pelas células da mucosa intestinal

27 Estrutura e Papel dos Polissacarídeos

28 Como os açúcares que ingerimos na alimentação entram na via glicolítica?
Outros açucares além da glicose: frutose e galactose

29 Frutose A frutose livre presente em frutos ou formada pela hidrolise da sacarose é fosofrilada pela hexoquinase. Esta é a principal via pela qual a frutose entra na via glicolítica. Frutose + ATP → frutose-6-fosfato + ADP No fígado a frutose entra na via glicolítica através da frutoquinase que catalisa a fosforilação do C1 da frutose. Frutose + ATP → frutose-1-fosfato + ADP A frutose-1-fosfato é clivada em gliceraldeído e diidroxicetona-fosfato pela frutose 1-fosfato aldolase. A diidroxicetona-fosfato é convertida em gliceraldeído-3-fosfato e o gliceraldeído é fosforilado. Portanto os produtos frutose-1-fosfato entram na via glicolítca como gliceraldeído-3-fosfato.

30 gliceraldeído-3-fosfato
Frutose Frutose-1-fosfato Frutose-1-fosfato-aldolase gliceraldeído + diidroxicetona-fosfato Triose quinase Frutose-1-fosfato-aldolase Entry of fructose to the glycolysis cycle may be problematic in some cases. Fructose can be converted to F6P by hexokinase. Fructose can also be converted to fructose-1-phosphate (F1P) by fructokinase. Conversion of F1P to glyceraldehyde and DHAP allows fructose to be metabolized by glycolysis without being controlled by PFK. Ingestion of a lot of fructose (via high fructose corn syrup in many foods) may be a factor in obesity. gliceraldeído-3-fosfato VIA GLICOLÍTICA

31 Como os açúcares que ingerimos na alimentação entram na via glicolítica?

32 Galactose Galactoquinase Galactose é um monossacarídeo resultante da hidrolise da lactose (açúcar presente no leite e seus derivados) Deficiency of galactose conversion enzymes results in accumulation of galactose (from breakdown of lactose). Excess galactose is converted to galactitol (a sugar alcohol). Galactitol in the human eye lens causes it to absorb water and this may be a factor in formation of cataracts.

33 Resumindo...

34 Os destinos do Piruvato
Condições anaeróbicas Condições anaeróbicas Condições aeróbicas

35 Um pouco de história... Louis Pasteur
1861: crescimento de leveduras, por grama de glicose, maior na presença do que na ausência de ar. “EFEITO PASTEUR”: Glicose consumida mais lentamente na presença de ar do que na ausência. Teoria vitalista (“força vital”) Eduard Buchner 1907 – Prêmio Nobel Derruba a Teoria vitalista – a fermentação ocorre sem vida organizada – Zimases Harden e Young 1909: isolamento do primeiro intermediário da via glicolítica 1929: Arthur Harden - Prêmio Nobel Descoberta de um procedimento para acelerar a fermentação: adição de Pi ao meio.

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37 Destinos do Piruvato em Anaerobiose
Fermentação (Reoxidação do NADH) Alcoólica Lática O equilíbrio da reação é favorecido em direção a formação do lactato devido ao G negativo da reação. Lactato é um “beco sem saída”

38 Otto Meyerhof 1922: Prêmio Nobel
Descoberta da correlação entre o consumo de oxigênio e o metabolismo do ácido lático nos músculos de coelho Ativador: obtido por autólise de levedura. O ativador perde a atividade se aquecido por 1 minuto a 50ºC e conserva-se bem em gelo. Você pode imaginar a natureza desse ativador? Para você é espantoso que se obtenha um ativador de músculo de coelho a partir de levedura?

39 Metabolismo do Etanol no Fígado
Álcool desidrogenase Ressaca Acetaldeído desidrogenase O álcool desidrogenase está presente no nosso corpo porque necessitamos metabolizar o álcool produzido em pequenas quantidades pela digestão e quebra dos carboidratos e, em grandes quantidades pelas bactérias em nosso intestino.

40 Hipoglicemia pelo Etanol

41 Sensibilidade Diferencial ao Etanol
Consumo de álcool segundo diferentes padrões levou a uma evolução divergente. Existem várias enzimas ADH no homem: dímeros (5 genes). ADH são essenciais pois quebram e metabolizam as moléculas de álcool (tóxico) que é absorvida para o sangue. População do Sudeste Asiático: maior intolerância ao álcool – acúmulo de acetaldeído – rubor alcoólico (“Asian flush”) Sudeste asíatico: ~ 50 % pop. possui o alelo mutante ALDH2*2 (8% da atividade do gene wt) Alcoolismo (tolerância ao álcool) Populações europeias: alelos ADH2 e ADH3 menos ativas metabolizam lentamente o etanol

42 Sensibilidade Diferencial ao Etanol
Homens x Mulheres

43 Regulação da Glicólise

44 Regulação da Glicólise

45 Regulação da via glicolítica
Fluxo de metabólitos de uma via metabólica pode ser modulado por: 1. Número de enzimas (por controles transcricionais/traducionais; Ocorre em minutos ou até horas). 2. Mudança da atividade enzimática (ocorre em segundos) por: Modificação covalente ou ligação a proteína reguladora Regulação alostérica Seqüestro da enzima ou do substrato em compartimentos diferentes

46 Via glicolítica Reações irreversíveis Hexoquinase Fosfofrutoquinase-1
G0’ = - 31,4 kJ/mol G0’ = - 16,7 kJ/mol Reações irreversíveis Hexoquinase Fosfofrutoquinase-1 Piruvato quinase DGº muito negativo G0’ = - 14,2 kJ/mol O fluxo da via glicolítica precisa se regulado em respostas às condições dentro e fora da célula. Duas demandas principais: Produção de ATP Fornecimento de blocos para biossíntese. 3 enzimas-chave: Hexoquinase Fosfofrutoquinase-1 Piruvato quinase

47 Hexoquinase HK Glicose + ATP Glicose-6-fosfato + ADP + H+ inibidor

48 Hexoquinase Isoformas [plasmática] de glicose = 5 a 8 mM
I, II e III – cinética michaelliana Km < 0,1 mM [plasmática] de glicose = 5 a 8 mM Ou seja, isoformas I, II e III funcionam sempre na Vmáx

49 Glicoquinase Hexoquinase (músculo): I, II, e III
Glicoquinase ou Hexoquinase IV – presente no fígado: menor afinidade pela glicose. Ligada a uma proteína reguladora forma um complexo inativo.

50 Glicoquinase Não é inibida por glicose-6-fosfato
Maior Km pela glicose: 10 mM Regulada pela [glicose]plasmática Regulação por sequestro no núcleo celular Estado Alimentado Hepatócito > 10 mM Glicose não é desperdiçada quando estiver abundante, síntese de glicogênio e ácidos graxos

51 Glicoquinase Não é inibida por glicose-6-fosfato
Maior Km pela glicose: 10 mM Regulada pela [glicose]plasmática Regulação por sequestro no núcleo celular Jejum Hepatócito Músculo? < 10 mM Fígado não compete com demais órgãos pela glicose escassa. Prioridade cérebro e músculo

52 Fosfofrutoquinase-1 (PFK-1)
Fru 6-F → Fru 1,6-bF A partir desse ponto o açúcar está comprometido com a via glicolítica Reação altamente exergônica e irreversível DG0’ = - 14,2 kJ/mol Além do sítio ativo essa enzima possui diversos sítios onde inibidores e ativadores alostéricos se ligam. Before this enzyme's reaction, glucose-6-phosphate can potentially travel down the pentose phosphate pathway, or be converted to glucose-1-phosphate for glycogenesis.

53 Reguladores Alostéricos da PFK-1
Negativos: ATP (retroinibição) e Citrato (CK) Positivos: AMP (músc. Esq.) e frutose 2,6-bifosfato ATP – Alta de energia (diminuição glicolítica) ADP, AMP – Baixa de energia (aumento da via glicolítica)

54 Reguladores Alostéricos da PFK-1
Negativos: ATP (retroinibição) e Citrato (CK) Positivos: AMP (músc. Esq.) e frutose 2,6-bifosfato De maneira pouco comum, o ATP, que é um substrato da enzima, também é um modulador alostérico negativo. A ligação do AMP reverte parcialmente a inibição provocada pelo ATP

55 Reguladores Alostéricos da PFK-1
Negativos: ATP (retroinibição) e Citrato (CK) Positivos: AMP (músc. Esq.) e frutose 2,6-bifosfato Quando a glicose é abundante, há um excesso de frutose-6-fosfato, que passa a ser fosforilada também pela PFK2, gerando frutose-2,6-bifosfato. A f2,6p é um modulador alostérico da PFK-1, aumentando a atividade dessa enzima.

56 Frutose-2,6-Bifosfato O ativador mais potente da via glicolítica

57 Enzima bifuncional (PFK2/F2,6BPase)
Atividades 6-fosfofruto-2-quinase e frutose-2,6-bifosfatase Regulação Alostérica Citrato Alta concentração de precursores biossintéticos O que quer dizer a animação? Um ano após a descoberta da PFK2, descobriu-se uma enzima que catalisava a reação reversa, defosforilando a frutose-2,6-bifosfato em frutose-6-fosfato. Por muito tempo tentou-se isolar a PFK-2 e a F2,6BPase, até descobrirem que elas eram uma única enzima PFK2

58 Regulação por Controle Covalente

59 Piruvato quinase Último passo da via glicolítica
Fosfoenolpiruvato + ADP → ATP + piruvato Tetrâmero apresentando diferentes isoformas L (fígado) e M (músculo) Regulação Alostérica Ativação anterógrada ATP /

60 Piruvato quinase Último passo da via glicolítica
Fosfoenolpiruvato + ADP → ATP + piruvato Regulação por controle covalente

61 Piruvato quinase Também é um tetrâmero apresentando diferentes isoformas em diferentes tecidos. Isoforma L (fígado) e isoforma M (músculo). Diferença: regulação por ligação covalente (fosforilação) This protein kinase phosphorylates liver pyruvate kinase to deactivate it. Muscle pyruvate kinase is not inhibited by epinephrine activation of protein kinase A. Glucagon signals fasting (no glucose available). Thus, glycolysis is inhibited in the liver but unaffected in muscle when fasting. An increase in blood sugar leads to secretion of insulin, which activates phosphoprotein phosphatase I, leading to dephosphorylation and activation of pyruvate kinase. These controls prevent pyruvate kinase from being active at the same time as the enzymes that catalyze the reverse reaction (pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase), preventing a futile cycle Fígado deixa de fazer glicólise quando a [glicose] no sangue cai

62 Regulação da via glicolítica

63 Via antagônica à glicólise: Gliconeogênese
Síntese de glicose a partir de compostos que não são carboidratos: aminoácidos, lactato e glicerol

64 Três reações precisam ser contornadas para se fazer o caminho inverso à glicólise (gliconeogênese)
Ênfase na etapa catalisada pela PFK-1. Assim como na PFK-2, existe uma enzima que catalisa a reação reversa: F1,6BPase.

65 Fosfofrutoquinase-1 e Frutose-1,6-Bifosfatase
Que também é regulada por F2,6BP, regulação em conjunto com a PFK-1 Inibição de Ciclo fútil

66 Frutose-2,6-Bifosfato

67 Regulação Glicólise x Gliconeogênese

68 Aspectos clínicos

69 1) Isquemia (Infarto do miocárdio):
Falta de suprimento sangüíneo para um tecido orgânico; Necrose do tecido por isquemia

70 2) Células tumorais: Otto Warburg – 1920
Células tumorais Ascites convertem glicose equivalente a 30% do peso seco em lactato/h (Músculo esquelético humano = 6% do peso seco em lactato/h) Em muitos tumores, a taxa de entrada de glicose e a glicólise aumentam por um fator 10. Efeito Warburg – Células malignas (invasivas) tem a via glicolítica aumentada em torno de 200x Na tomografia de emissão de positrons podemos ver a captação de fluodeoxiglicose, mostrando localização de tumores com alta captação desse composto (Via glicolítica aumentada) Explicações para o efeito Warburg - The Warburg effect may simply be a consequence of damage to the mitochondria in cancer, or an adaptation to low-oxygen environments within tumors, or a result of cancer genes shutting down the mitochondria because they are involved in the cell's apoptosis program which would otherwise kill cancerous cells

71 Transformação de uma célula normal para tumoral:
Mudança para um metabolismo glicolitico; Tolerância a baixo pH; Mais o tumor é agressivo maior é a sua taxa de fluxo glicolítico (superxpressão de enzimas glicolíticas e dos transportadores)