Luciana Maria de Hollanda (Lu) Professora de Pós-Graduação em

Apresentação em tema: "Luciana Maria de Hollanda (Lu) Professora de Pós-Graduação em"— Transcrição da apresentação:

1 Luciana Maria de Hollanda (Lu) Professora de Pós-Graduação em
Boa Tarde a todos para quem não me conhece ainda, meu nome é Luciana mais, podem me chamar de Lu, fico grata pela participação deste evento e por ter sido novamente convidada para participar do mesmo. Fico mais feliz ainda porque, nesta terceira edição é a minha terceira participação e é prá mim uma enorme alegria estar ministrando essa palestra para vcs. Diferente dos outros anos, esse ano eu não falarei nem de terapia gênica e nem de biologia sintética... Mas o que eu vou falar, tem um pouco a ver com a aula dos anos anteriores.. Pois trata-se de terapia... Só que utilizando nanopartículas para tentar melhorar o quadro clínico de pacientes e, diagnosticar melhor uma das principais patologias que assolam a raça humana.... Que é o câncer, por isso esste título... Nanoncologia.... Ou seja é o emprego de nanopartículas no tratamento, diagnóstico e cura tumoral... Mas antes de falarmos sobre esse assunto faremos uma breve introdução... A respeito de conceitos básicos.... e Vou explanar um pouco a respeito de Nanoncologia, que é o principal enfoque do meu trabalho atual. O que eu já consegui fazer na UNICAMP e como estão as coisas.... Luciana Maria de Hollanda (Lu) Professora de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial (ITP) Professora do Curso de Graduação em Enfermagem (UNIT)

2 NANONCOLOGIA A Arte de Tratar e Marcar as
Células tumorais Nanopartículas

3 Para entender o que é Nanoncologia
Alguns pré-requisitos são necessários Para isso precisamos entender: O que é uma célula A diferença entre célula normal e tumoral Formas de Tratamento da Célula Tumoral O que é Nanotecnologia O que é Nanoncologia Portanto...

4 Como todos nós… … sabemos…

5 Nós, os seres humanos… Portanto???? 10 trilhões de células FORMADOS
CONSTITUÍRAM Todos nós seres humanos por mais esquisitos que sejamos, independente de nossa raça, credo ou preferência sexual temos em nosso corpo aproximadamente 10 trilhões de células que constituírão os diferentes tipos de tecidos e órgãos Portanto a célula Portanto???? Os DIFERENTES TIPOS DE ÓRGÃOS E TECIDOS

6 A Célula… Porque???? É a unidade morfofuncional
De todos os organismos vivos multicelulares Sendo dividida em Membrana Citoplasma Núcleo Cromossomos Arcabouço Hereditário que originarão as nossas Características fenotípicas DE TODOS OS ORGANISMOS VIVOS SENDO DIVIDIDA EM MEMBRANA, CITOPLASMA E NÚCLEO, SENDO QUE NO NÚCLEO, ENCONTRAMOS OS CROMOSSOMOS QUE ORIGINARÃO AS NOSSAS CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS Porque????

7 Cada Cromossomo… Sendo que Um gene
É formado por uma Longa seqüência de DNA Onde encontraremos Diversas Regiões Gênicas Sendo que Um gene Cada cromossomo é formado por uma longa sequencia de DNA onde encontramos diversas regiões gênicas....

8 Codificará uma sequencia primária de algum produto gênico final – polipeptídeo ou proteína um RNA com uma função catalítica ou estrutural

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10 Dogma Central da Biologia…

11 … desequilibrio do dogma central…
...para grupos gênicos relacionados... Forma Tempo de crescimento Morte celular Formação Célula alterada Célula Normal Célula Alterada Desequilibrio do dogma central biologia

12 … essa célula alterada…
… Gerando…

13 TUMORES BENIGNOS Agora quando.... São limitados em seu crescimento
Não invadem os tecidos adjacentes Incapazes de causar metástases sem invadir os tecidos adjacentes e não causando metástase ela é considerada um tumor benigno, agora se o surto.... Agora quando....

14 Célula cresce e se divide sem respeitar os limites normais
Invadindo e destruindo os tecidos adjacentes Espalhando-se para outros lugares do corpo Doença Câncer ou Neoplasia Maligna For gravíssimo e ela fica que nem uma louca crescendo desesperadamente, invadindo e destruindo os tecidos adjacentes e soltando pequenos fragmentos celulares e espalhando esses fragmentos para diversas partes do corpo é conhecido como câncer ou neoplasia maligna. Um importante cientista....

15 Peyton Rous Ganhou o premio nobel – Sarcoma de Rous Declarou que....
“Os tumores destroem o homem de maneira peculiar e apavorante, já que a carne de sua própria carne de alguma forma se torna proliferativa, agressiva, predatória e ingovernável.” Desta maneira

16 O que é o Câncer? Doença multifatorial e crônica De difícil tratamento
Altamente complexa Muitas vezes incurável Alterações genéticas – certos grupos gênicos Conferem as células Características Especiais como Capacidade ilimitada de proliferação Incapacidade de entrar em apoptose Metastização Angiogênese doenças multifatoriais crônicas causadas principalmente por alterações genéticas que conferem às células algumas características especiais como, capacidade ilimitada de proliferação, incapacidade de entrar em apoptose, metastização e angiogênese, tornando-as altamente complexas, muitas vezes incuráveis e difíceis de serem tratadas

17 Como se origina?

18 Ambas interrelacionadas entre si
O que causa? Causas do Câncer → Variadas Causas Externas Causas Internas Meio Ambiente Hábitos e Costumes De um ambiente sócio-cultural Geneticamente pré-determinadas Relacionam-se Capacidade do Organismo Se defender dos Fatores Externos Ambas interrelacionadas entre si s causas de câncer são variadas, podendo ser externas ou internas ao organismo, estando ambas inter-relacionadas. As causas externas relacionam-se ao meio ambiente e aos hábitos ou costumes próprios de um ambiente social e cultural. As causas internas são, na maioria das vezes, geneticamente pré-determinadas, estão ligadas à capacidade do organismo de se defender das agressões externas. Esses fatores causais podem interagir de várias formas, aumentando a probabilidade de transformações malignas nas células normais.

19 80 a 90% das Causas - Externas
De todos os casos, 80% a 90% dos cânceres estão associados a fatores ambientais. Alguns deles são bem conhecidos: o cigarro pode causar câncer de pulmão, a exposição excessiva ao sol pode causar câncer de pele, e alguns vírus podem causar leucemia. Outros estão em estudo, como alguns componentes dos alimentos que ingerimos, e muitos são ainda completamente desconhecidos.

20 Enquanto que…. Causas Internas
Geneticamente pré-determinadas Mutações hereditárias Cancer de Mama Alterações nos genes brca1 e brca2 Mutações Somáticas Adquiridas por fatores ambientais

21 Portanto… As interações complexas entre
Carcinógenos e o genoma do hospeiro Explicam porque Alguns desenvolvem câncer Após a exposição a um carcinógeno e outros não Os processos que levam a oncogênese são Complexos O que dificulta o seu tratamento

22 Incidência – Em quem ocorre?
Em todas as idades sendo mais freqüente em idosos

23 Apesar dos grandes esforços…
Combate Prognóstico Tratamento As neoplasias malignas Apresentam altas incidências de morte Segundo relatório da OMS A incidência do Câncer mais que dobrou Nos últimos 30 anos 2008 – 12,4 milhões de novos casos 7,6 milhões de óbitos (Who, 2009) O câncer é uma das patologias que mais preocupam a saúde pública mundial (Nagahara et al. 2010). Segundo relatório da Agência Internacional para Pesquisa em Câncer (IARC)/OMS, o impacto global dessa doença, mais que dobrou nos últimos 30 anos. Estatísticas mundiais demonstraram que, no ano de 2008 advieram aproximadamente 12 milhões de casos novos com 7,6 milhões de óbitos (WHO 2009).

24 Tipos mais incidentes Câncer de Pulmão é o mais comum
1,2 milhão de casos novos anuais Câncer de Mama Feminina é o segundo mais comum 1 milhão de casos novos anuais Câncer Colo-Retal é o terceiro mais comum 940 mil casos novos anuais

25 Em 2020? 15 milhões de casos novos 12 milhões de mortes
As maiores taxas de incidência de câncer são encontradas nos países desenvolvidos (Estados Unidos, Itália, Austrália, Alemanha, Canadá e França)

26 No Brasil ??? Segundo dados do INCA Para este ano de 2011
489 mil novos casos serão diagnosticados Sendo a segunda principal Doença com causa mortis conhecida Os tipos mais comuns serão Pele tipo não melanoma Os tipos mais incidentes, à exceção do câncer de pele do tipo não melanoma, serão os cânceres de próstata e de pulmão no sexo masculino e os cânceres de mama e do colo do útero no sexo feminino, acompanhando o mesmo perfil da magnitude observada para a América Latina. PROSTATA PULMÃO MAMA COLO DE ÚTERO

27 Porque os casos de câncer de Próstata estão aumentando?

28 Como Tratar??? Até o presente momento
As principais metodologias curativas são Embora eficazes, ainda apresentam alguns problemas como Até o presente momento, as principais metodologias curativas ainda são a quimioterapia, radioterapia e cirurgia. Quimioterapia Cirurgia Radioterapia

29 Problemas das metodologias curativas atuais
Distribuição Sistêmica não específica Dos agentes tumorais Gerando efeitos colaterais Baixa tolerância de alguns pacientes ao Tratamento Alta citotoxicidade Também para células normais Desenvolvimento de resistência a droga De alguns tumores Embora eficazes alguns problemas ainda aconteçam como, distribuição sistêmica não específica dos agentes antitumorais, baixa tolerância de alguns pacientes ao tratamento, alta citotoxidade para as células normais e desenvolvimento de múltipla resistência às drogas (Parveen et al. 2006; Parveen et al. 2008; Misra et al. 2010; Wang et al. 2010). Portanto….

30 Torna-se importante que….
Que novas metodologias tecnológicas Desenvolvam-se com o intuito de: Delinear a margem tumoral Separar células neoplásicas malignas das normais Identificar micromestátases - tumor Foi completamente removido ou não Diante desta ótica Diversos pesquisadores da área oncológica Voltaram a sua atenção para a Nanotecnologia Com o intuito de.... Diante dessa ótica, diversos pesquisadores da área oncológica, voltaram a sua atenção para a nanotecnologia com o intuito de

31 Encontrar e Descobrir….
Metodologias mais eficazes no Combate Controle Diagnóstico Câncer. Para estimular essa área o encontrar metodologias mais eficazes e efetivas no combate ao câncer (Chan 2006; Lacerda et al. 2006; Farrell et al. 2010a; Farrell et al. 2010b). Para estimular essa área científica, o National Institute of Health (NIH) e o National Institute of Cancer (NCI) montaram no ano de 2005, o programa NCI Alliance for Nanotechnology que reuniu os principais nanotecnólogos mundiais, para incentivar a descoberta de novos paradigmas de detecção, prevenção e tratamento do câncer (Farrell et al. 2010a; Farrell et al. 2010b; Jain 2010; Nagahara et al. 2010; Ptak et al. 2010). Principais oncologos mundiais reunidos, para incentivar a descoberta de novos paradigmas de detecção, combate e prevenção do câncer Fundaram em 2005

32 Porque nanotecnologia??
Porque é uma ciência que manipula Átomos Moléculas Em escala nanométrica (1x10-9m ou 1 milionésimo de milímetro) Como são partículas Muito pequenas São facilmente Internalizadas pelas células Por endocitose Utilização da Nanotecnologia em Sistemas biológicos NANOBIOTECNOLOGIA Para o tratamento, combate e cura do Câncer NANONCOLOGIA A nanotecnologia é uma ciência que manipula átomos, moléculas e estruturas supramoleculares para criar e utilizar materiais, dispositivos e sistemas em escala nanométrica. Dessa maneira, dada a pequenez de suas partículas, esses nanomateriais são facilmente endocitados pelas células. Assim, a utilização da nanotecnologia em sistemas biológicos recebeu o nome de nanobiotecnologia (Jain 2010; Ptak et al. 2010; Shiba 2010).

33 Figura 1. Papel da nanobiotecnologia no tratamento do câncer (nanoncologia). Este esquema demonstra o papel da Nanobiotecnologia e sua interação em várias outras metodologias no tratamento do câncer (Jain, 2010).

34 Lipoplexos e poliplexos
Monocamadas Bicamadas Fosfolipídicas Hidrofóbicas Que formam micelas Com isso conseguem proteger Material nuclear Droga Que será inserido na célula tumoral Além disso Podem ser modificados Para que a sua superfície contenha Receptores celulares específicos Que se ligariam somente ao cancer Para melhorar a entrega do DNA novo na pilha, o DNA deve ser protegido dos danos e sua entrada na pilha deve ser facilitada. Às moléculas novas desta extremidade, os lipoplexes e os polyplexes, foram criados que têm a habilidade de proteger o DNA da degradação indesejável durante o processo do transfection. O DNA do Plasmid pode ser coberto com os lipids em uma estrutura organizada como um micelle ou um liposome. Quando a estrutura organizada é complexed com DNA está chamado um lipoplex.

35 Lipossomos Geralmente apresentam
Baixa imunogenicidade Fáceis de serem construídos Excelentes carregadores de material genético Apresentam Gama diversificada Tamanho Características Liberação do material internalizado Podem ser Alvo específicos Além disso, os lipossomas veículos de entrega oferecer versatilidade com uma gama diversificada de mor- phologies, tamanho e características de liberação, pode ser usado para tis- sue alvo e fornecer a proteção do DNA plasmidial do ataque de nucleases de degradação. Desde a sua introdução como sistemas de entrega em potencial em 1987

36 Tipos de Lipossomos Aniônico Neutros e Catiônicos
Carregado Negativamente Neutros e Catiônicos Carregados Positivamente Aniônicos Catiônicos Há três tipos de lipoplexes, anionic (carregado negativamente), neutros ou cationic (carregado positivamente).

37 Lipossomos Aniônicos e Neutros
Primeiramente utilizados como vetores sintéticos Apresentam baixa citotoxicidade São compatíveis com líquidos do corpo Podem carregar em sua membrana Anticorpos Antígenos Receptores de membrana Utilizados no tratamento de Câncer Fibrose Cística Hemofilia Inicialmente, os lipids anionic e neutros foram usados para a construção dos lipoplexes para vetores sintéticos. Entretanto, embora haja pouco toxicity associado com eles, são compatíveis com líquidos de corpo e havia uma possibilidade de adaptá-los para estar um específico do tecido, são complicados e tempo - consumindo para produzir assim que a atenção foi girada para as versões cationic.

38 Drogas antitumorais utilizando nanocarreadores aprovadas para uso clínico
Tabela I. Drogas antitumorais utilizando nanocarreadoresa aprovados para uso clínico

39 Como visto anteriormente…
Os principais nanocarreadores Atualmente utilizados são Lipossomos Conjugados Drogas Proteínas Que apesar de salvar o paciente Ainda geram efeitos colaterais Diarréia Perda de cabelo Perda de apetite Dores generalizadas Nausea e Vômito

40 Novos Nanocarreadores
E AGORA GALERA… O QUE FAZER???? Novos Nanocarreadores

41 NANOTUBOS DE CARBONO Foram descobertos por Ijima em 1991
E consistem exclusivamente Átomos de Carbono Arranjados numa série de anéis de benzeno Condensados e enrolados De maneira tubular Classificados de acordo com a sua estrutura SWNT – Single Wall Nanotube Única folha de grafeno enrolada MWNT – Multi Wall Nanotube Múltiplas folhas enroladas Nanotubos de Carbono (NTC) Os nanotubos de carbono (NTC) consistem exclusivamente de átomos de carbono arranjados numa série de anéis de benzeno condensados e enrolados de maneira tubular.

42 Devido as suas propriedades físico-químicas…
Classificação SWNT – Single Wall Nanotube Única folha de grafeno enrolada Diâmetro: Entre 0,4 a 3,0nm Comprimento: Entre 20 a 1µm MWNT – Multi Wall Nanotube Múltiplas folhas enroladas Diâmetro: Entre 1,4 a 100 nm Comprimento: Entre 1µm a 5µm São classificados de acordo com a sua estrutura, portanto divididos em, single-walled (SWNT) que possuem uma única folha de grafeno, e o multi-walled (MWNT) que contêm múltiplas folhas concêntricas enroladas. Enquanto que, os MWNT são maiores com diâmetro entre 1,4 a 100 nm e comprimento entre 1 a muitas micra (Lacerda et al. 2006; Menard-Moyon et al. 2010). Devido as suas propriedades físico-químicas, Devido as suas propriedades físico-químicas…

43 Principal Defeito… São endociticamente Internalizados pelas Células
MNWT+Proteína SWNT+DNA São endociticamente Internalizados pelas Células Transportando Moléculas orgânicas como DNA RNA principalmente RNAi Proteínas Drogas SWNT+RNAi SWNT+Drogas são endociticamente internalizados pelas células (Shi Kam et al. 2004; Kostarelos et al. 2009; Liu et al. 2009; Liu et al. 2011). Além disso, são capazes de transportar drogas e moléculas orgânicas como DNA, RNA e Proteínas (Ajima et al. 2005; Kam et al. 2005; Zhang et al. 2006; Prato et al. 2008; Al-Jamal et al. 2010; Ciofani et al. 2010; Higuchi et al. 2010; Ladeira et al. 2010; Taratula et al. 2011). Principal Defeito…

44 Insolubilidade na maioria dos solventes orgânicos…
O que torna a sua manipulação Extremamente difícil e limitada O que fazer então???? PARAR DE USAR OS NANOTUBOS DE CARBONO? FUNCIONALIZAR.... Ou SEJA? Misturar esse nanotubo de carbono Com outra substância que fique mais fácil a sua Diluição nos Solventes orgânicos Principais substâncias utilizadas PEG P85 Entre outras Certamente tanto os SWCNTs quanto os MWCNTs funcionalizados, apresentam boa capacidade de passar pelas barreiras biológicas agindo como moléculas ativamente terapêuticas (Kostarelos et al. 2007; Bhirde et al. 2009; Kostarelos et al. 2009; Liu et al. 2010). Corroborando com esses dados, Bachilo e colaboradores no ano de 2002, demonstraram que os SWCNTs são fotoluminescentes quando submetidos aos raios infravermelhos (NIR)(Bachilo et al. 2002). Dessa forma, esse material torna-se de grande serventia nos diagnósticos clínicos em diversos tipos de exames (Welsher et al. 2008; Ruggiero et al. 2010; Thakare et al. 2010; Yang et al. 2010; Markovic et al. 2011). Em contraste, os MWCNTs por possuírem maior diâmetro interno foram explorados para o encapsulamento de moléculas terapêuticas. Além disso, por terem maior superfície externa, ofereceram mais possibilidades de conjugação e/ou interação com moléculas ativas do que os SWCNTs (Ren 2007).

45 Até o presente momento sabemos que…
Tanto os SWNT MWNT Funcionalizados Apresentam boa capacidade De passar pelas barreiras biológicas Agindo como moléculas ativamente terapeuticas SWNT funcionalizado e marcado com fluoróforo verde, enquanto o núcleo da célula tumoral, foi marcado em vermelho. Corroborando com esses dados, Bachilo e colaboradores no ano de 2002, demonstraram que os SWCNTs são fotoluminescentes quando submetidos aos raios infravermelhos (NIR)(Bachilo et al. 2002). Dessa forma, esse material torna-se de grande serventia nos diagnósticos clínicos em diversos tipos de exames (Welsher et al. 2008; Ruggiero et al. 2010; Thakare et al. 2010; Yang et al. 2010; Markovic et al. 2011). Em contraste, os MWCNTs por possuírem maior diâmetro interno foram explorados para o encapsulamento de moléculas terapêuticas. Além disso, por terem maior superfície externa, ofereceram mais possibilidades de conjugação e/ou interação com moléculas ativas do que os SWCNTs (Ren 2007).

46 Além disso foi demonstrado por…
Bachilo e Colaboradores – 2002 Demonstraram que: SWNT são fotoluminescentes Quando submetidos aos raios infravermelhos Leeum e Colaboradores – 2007 Demonstrou fotoluminescencia de SWNT Em larvas de Drosophila melanogaster Corroborando com esses dados, Bachilo e colaboradores no ano de 2002, demonstraram que os SWCNTs são fotoluminescentes quando submetidos aos raios infravermelhos (NIR)(Bachilo et al. 2002). Dessa forma, esse material torna-se de grande serventia nos diagnósticos clínicos em diversos tipos de exames (Welsher et al. 2008; Ruggiero et al. 2010; Thakare et al. 2010; Yang et al. 2010; Markovic et al. 2011). Em contraste, os MWCNTs por possuírem maior diâmetro interno foram explorados para o encapsulamento de moléculas terapêuticas. Além disso, por terem maior superfície externa, ofereceram mais possibilidades de conjugação e/ou interação com moléculas ativas do que os SWCNTs (Ren 2007).

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48 Além disso… Liu e Colaboradores- 2008 Conjugaram SNWT PEG Paclitaxel
Os autores demonstraram que no modelo de cancer de cabeça murino Esse composto SNWT-PEG-Paclitaxel Apresentou Baixa Citotoxicidade Alta biocompatibilidade Excreção, via biliar sem causar efeitos tóxicos as células normais Acumulação principalmente na massa tumoral Sendo considerada uma conjugação promissora – Terapia Antitumoral, com baixo efeito colateral

49 Enquanto isso… Srivastava e colaboradores – 2010 – Observaram que:
MWCNT Induziram apoptose em Linhagens celulares de A549 (Adenocarcinoma de pulmão) A internalização dos MWCNTs foi observada Microscopia Eletrônica E as alterações apoptóticas foram estimadas Condensação Nuclear Marcação de DNA Confirmada pela expressão de marcadores apoptóticos como: P53, P21, Bax, Bcl-2, Caspase-3 ativada Os autores observaram que… As células entraram em apoptose Desenvolveram um novo modelo de MWCNT Na indução da apoptose para este tipo celular Non-cytotoxic doses of MWCNTs were identified using tetrazolium bromide salt (MTT) and lactate dehydrogenase (LDH) release assays. Cells were exposed to MWCNTs ( mug/ml) for 6-72 h. Internalization and characterization of CNTs was performed by electron microscopy. Apoptotic changes were estimated by nuclear condensation, DNA laddering, and confirmed by expression of associated markers: p(53), p(21WAF1/CIP1), Bax, Bcl(2) and activated caspase-3.

50 Já que todo mundo testou…
Eu e Alunos Fizemos um ensaio de transfecção celular Para ver se o nanotubo produzido pelo Departamento de Fotonica da UNICAMP Entrava dentro da célula tumoral

51 O MWCNT produzido na UNICAMP…
Foi funcionalizado com P85 poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno) pluronic E conjugado com o plasmídeo de fluorescencia pIRES Desta maneira nós observamos que..... Este nanovetor não é citotóxico Apresenta boa invasibilidade celular Produzindo melhor fluorescencia que o controle utilizado.

52 Resultados observados…

53 Esses resultados originaram…

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55 Além das nanopartículas de carbono…
...as nanopartículas mesoporosas de Sílica também foram testadas No tratamento tumoral Com significativos resultados

56 Nanopartículas mesoporosas de sílica
Utilizadas na indústria como Aditivos em Cosméticos Fármacos Toners de Impressoras Vernizes Com a comercialização desses produtos O interesse em sua citotoxicidade Para a população aumentou A única propriedade físico-química que apresentaram Riscos potenciais a saúde humana Incluem maior capacidade de penetração celular Principalmente Pulmão e Circulação Sistêmica Com o crescimento e a comercialização dos produtos nanotecnológicos, a exposição humana aos NPSs aumentou e, muitos dos aspectos relacionados com o tamanho desses nanomateriais levantaram preocupações sobre a sua segurança e comercialização (Maynard et al. 2006; Maynard 2007; Napierska et al. 2010). Investigaram-se as propriedades citotóxicas das partículas de sílica na forma cristalina entre 0,5 a 10 μm de tamanho e foi descoberto que essas partículas possuem diferenças toxicológicas quando comparadas com as NPSs. A única propriedade físico-química das NPSs que apresentam riscos potenciais a saúde humana, incluem maior capacidade de penetração celular principalmente no pulmão e na circulação sistêmica (Napierska et al. 2010).

57 Mas são justamente essas propriedades….
Além da biocompatibilidade Que tornam essas nanopartículas Grandes promessas No tratamento tumoral Principalmente se forem direcionadas Para se ligarem a receptores específicos tumorais Célula tumoral Hela corada em verde Nanopartícula mesoporosa de sílica corada em vermelho

58 Dessa forma as NMS…. Foram utilizadas como
Vetores para o carregamento de compostos combinados Drogas e Genes Drogas e RNAi Devido a sua grande compatibilidade com fármacos Por possuírem grandes áreas de superfície Canais Porosos Ordenados São propícias para o carregamento de Drogas Antineoplásicas como Doxorrubina Paclitaxel Camptotecina as nanopartículas mesoporosas de sílica (NMS) foram utilizadas como vetores no carregamento de compostos combinados como, drogas e genes e, drogas e RNAi. Devido a sua grande compatibilidade com fármacos e, por possuírem grandes áreas de superfície e canais porosos ordenados, essas NMS são propícias para o encapsulamento e carregamento de drogas antineoplásicas como, doxorrubicina, paclitaxel e camptotecina (Vijayanathan et al. 2002; Ravi Kumar et al. 2004; Salata 2004; Lu et al. 2007; Panessa-Warren et al. 2008). Além disso, os NMSs possuem a superfície química bem estabelecida facilitando dessa forma, sua modificação com policátions, permitindo a preparação do híbrido orgânico-inorgânico que servirá também como carreador de ácidos nucléicos. Dessa forma, a grande vantagem dos NMSs sobre outros carreadores é que sua estrutura porosa permite a ligação tanto de ácidos nucléicos na sua superfície como o encapsulamento de grande quantidade de pequenas moléculas no seu interior (Bhattarai et al. 2010).

59 Além disso por possuírem….
Superfície química bem estabelecida Facilita a sua modificação com policátions Permitindo que um híbrido Orgânico – Inorgânico seja preparado Facilitando que ácidos nucléicos Sejam carreados Dessa forma, Além disso, os NMSs possuem a superfície química bem estabelecida facilitando dessa forma, sua modificação com policátions, permitindo a preparação do híbrido orgânico-inorgânico que servirá também como carreador de ácidos nucléicos. Dessa forma, a grande vantagem dos NMSs sobre outros carreadores é que sua estrutura porosa permite a ligação tanto de ácidos nucléicos na sua superfície como o encapsulamento de grande quantidade de pequenas moléculas no seu interior (Bhattarai et al. 2010).

60 A grande vantagem dos NMSs sobre outros carreadores é que sua estrutura porosa permite a ligação tanto de ácidos nucléicos na sua superfície como o encapsulamento de grande quantidade de pequenas moléculas no seu interior.

61 A Habilidade das NMS modificadas….
Com policátions de carrearem RNAi e Genes Cultura de célula in vitro Foram relatadas por alguns autores Com resultados positivos Xia e Colaboradores – 2009 Demonstraram que NMS quando funcionalizadas com PEI (Polietilenoilamina) Carrearam tanto RNAi Como DNA plasmidial PEIs are synthetic cationic polymers that compact DNA and siRNA into complexes that are effectively taken up in cells to make nucleic acid delivery and gene therapy possible. 2123 Although the polymer itself is used as a delivery vehicle, PEI can also be attached to nanoparticle surfaces through covalent and electrostatic interactions to achieve the same goal. 11,16,17,19,24 Complexing the polymer with the nanoparticles has the potential advantage of facilitating DNA and siRNA delivery by a multifunctional platform that also allows imaging, targeting, and concurrent drug delivery. A habilidade das NMSs modificados com policátions entregarem genes e RNAi em culturas de células foi relatada e demonstrada por alguns autores (Radu et al. 2004; Xia et al. 2009; Bhattarai et al. 2010). Xia e colaboradores prepararam SMN catiônicos com potencial carregador, pela adsorção de polietilenoimina (PEI) e, demonstraram que as nanopartículas puderam carrear RNAi e DNA plasmidial (Xia et al. 2009). A presença de PEI, não prejudicou a capacidade dessas nanoestruturas abrigarem fármacos pouco solúveis em sua composição, como por exemplo, o paclitaxel. No ano de 2009, Chen e colaboradores combinaram simultâneamente numa NMS, um RNAi para Bcl-2 e a droga doxorrubicina. Esse composto complexo, aumentou a sensibilidade das células tumorais ao quimioterápico em testes in vitro (Chen et al. 2009). Dessa forma é de extremo interesse que novas combinações sejam feitas, para obtermos novas drogas e quiçá novas patentes elaboradas por mim.

62 O que são PEI…. São polimeros catíonicos sintéticos que
Compactam o DNA e o RNAi Em complexos que entram mais Facilmente dentro das células Sendo bastante utilizados Em terapia Gênica

63 Xia e colaboradores demonstraram que….
Quanto maior o tamanho do PEI mais partículas fluorescentes são internalizadas na célula tumoral Células marcadas em vermelho NMS marcadas em verde

64 Concluindo que…. NMS ligada a PEI É um sistema de entrega versátil
Que facilita a captura celular de Ácidos Nucleicos e Drogas Embora a citotoxicidade do conjugado seja alta É possível selecionar o tamanho do polímero Que entregue eficientemente RNAi Sem danificar a célula como um todo Enquanto PEIs de baixo peso molecular Sejam ineficientes para a entrega gênica São eficientes para aumentar a entrega de drogas antitumorais DESTA FORMA, ESSES HÍBRIDOS SÃO POTENCIALMENTE IMPORTANTES NA ENTREGA DE NUCLEOTÍDEOS E PEQUENAS MOLÉCULAS AS CÉLULAS Enquanto ineficiente para a entrega do gene, revestimento com polímeros de baixo peso molecular PEI é mesmo assim eficiente para aumentar a entrega de drogas antitumorais paclitaxel em células cancerosas. estes híbridos organicinorganic nanopartículas porosa pode potencialmente ser úteis para a entrega simultânea de nucleotídeos e pequenas moléculas em células.

65 Chen e Colaboradores, 2009 Construíram uma NMS
Que carreia simultaneamente Doxorrubicina RNAi para Bcl-2 Este complexo aumentou a sensibilidade Das células tumorais antes resistentes Ao quimioterápico em testes in vitro No ano de 2009, Chen e colaboradores combinaram simultâneamente numa NMS, um RNAi para Bcl-2 e a droga doxorrubicina. Esse composto complexo, aumentou a sensibilidade das células tumorais ao quimioterápico em testes in vitro (Chen et al. 2009).

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67 Além dos materiais inorgânicos
Até agora descritos na Transferência do material genético Diversos laboratórios exploraram a utilização de Vírus e Bactérias atenuadas Como carreadores biológicos. Diversos laboratórios exploraram a utilização de vírus e bactérias atenuados como carreadores biológicos em ensaios in vivo (Pilgrim et al. 2003; Bangari et al. 2005; Giacalone et al. 2006).

68 Bactérias e Câncer Primeiras observações
Streptococcus pyogenes Primeiras observações Bactérias utilizadas como agentes antitumorais Foram realizadas ao acaso W. Busch e F. Fehleisen observaram que Certos tipos de câncer regrediram quando pacientes internados para o tratamento do tumor eram infectados por Streptococcus pyogenes e desenvolviam erisipela William Coley – paciente com câncer cervical Rescindiu do tumor - após ter erisipela Nenhum destes pesquisadores desenvolveu – nova terapia para o câncer Por causa das complicações decorrentes deste tipo de terapia As primeiras observações de que bactérias poderiam ser utilizadas como agentes anticancerígenos foram realizadas independentemente, ao acaso, por dois médicos alemães no século XX. Os doutores W. Busch e F. Fehleisen observaram que certos tipos de câncer regrediram quando pacientes internados para o tratamento de tumores eram acidentalmente infectados por Streptococcus pyogenes e desenvolviam. William Coley percebeu que um de seus pacientes que sofria de câncer cervical começou a se recuperar do tumor, após ser acometido por erisipela. Infelizmente, nenhum destes pesquisadores desenvolveu uma nova terapia para o câncer utilizando bactérias, devido à toxicidade e as complicações decorrentes deste tipo de terapia. No entanto, suas descobertas motivaram os avanços encontrados nos dias de hoje erisipela.

69 Bactérias e Câncer Muitos anos após esses trabalhos
Tratamento de tumores sólidos com bactérias – Ressurgiu Porque ??? as bactérias - geneticamente modificadas Perdendo os seus fatores de virulência Vetores para genes que codificam proteínas Atividades Antitumorais Dentre os diversos trabalhos Destacam-se

70 Clostridium X Câncer Bactérias anaeróbias
Capazes de proliferar preferencialmente Dentro de regiões de necrose tumoral Modelos animais Reduzindo e combatendo a massa tumoral Estimular a resposta imunológica Atacar e destruir o tumor Principal Problema utilização Mesmo com todas as atenuações realizadas Mecanismos de Patogenicidade Alguns animais ainda morrem Trabalhos realizados com bactérias patogênicas anaeróbicas do gênero Clostridium foram capazes de proliferar, preferencialmente, dentro de regiões de necrose tumoral em tecidos animais

71 Bacilo de Calmette-Guerin x Câncer
Estudos bacilo de Calmette-Guerin (BCG), linhagem de Mycobacterium bovis possui o mesmo mecanismo imunoestimulatório que Clostridium novyi sem, no entanto, ser patogênica em humanos. Até o presente momento, Estudos para o tratamento de câncer de bexiga Utilizando o BCG foram bem sucedidos Com remissão da doença

72 Salmonella typhimurium x Câncer
Recentes estudos com Salmonella typhimurium (ST) demonstraram diferentes linhagens quando atenuadas servem como agentes antitumorais crescendo preferencialmente nestes locais O mecanismo pelos quais a (ST) prefere a célula tumoral – Não Esclarecido Mas acredita-se que os principais fatores sejam Maior disponibilidade de nutrientes liberados pelos tumores Em regiões de hipóxia Diminuição da atividade bactericida de Macrófagos e Neutrófilos – Em hipóxia Supressão do sistema imune Exposição reduzida a anticorpos e complemento devido irregularidades da vascularização tumoral

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74 Apesar da eficácia…. Muitos experimentos foram suspensos
Uma vez que, modelos murinos Apresentaram efeitos colaterais Além disso, A reversão para a forma patogênica O risco de transferência gênica horizontal Aumento das respostas a citosinas pró-inflamatórias Também corroboraram para o descrédito Desta tecnologia. Apesar da eficácia demonstrada, os experimentos foram suspensos, uma vez que, muitos modelos murinos apresentaram efeitos colaterais (Bangari et al. 2005; Wang et al. 2005; Giacalone et al. 2006). As reações adversas provocadas por esses vetores incluem, a reversão para a forma patogênica, o risco de transferência gênica horizontal e, o aumento de citosinas pró-inflamatórias (Donsante et al. 2001).

75 Em alguns casos…. Vetores utilizando Adenovírus Adenoassociados
Integraram no genoma da célula hospedeira DNA exógeno Alterando a maquinaria transcricional Criando lesões gênicas que levaram o aparecimento Tumoral Carreadores Virais Também possuem limitada Quantidade de material genético a ser entregue Limitando sua aplicação Adenovírus Em alguns casos os vetores utilizando adenovírus ou adenoassociados integraram no genoma da célula hospedeira, DNA exógeno que alterou a maquinaria transcricional criando lesões gênicas que originaram o desenvolvimento tumoral (Donsante et al. 2001). Além disso, carreadores virais também possuem limitada quantidade de material genético a ser entregue, limitando sua aplicação (Giacalone et al. 2006).

76 Minicélulas Apesar de bactérias atenuados
Serem eficientes veículos de transferência de DNA Seu alvo continua inespecífico Dessa forma, surgiu a idéia de utilizar minicélulas bacterianas acromossômicas como carreadores gênicos. As minicélulas São produzidas através da septação ectópica Durante a divisão celular, Possuem todos os componentes moleculares, menos o cromossomo

77 Como são produzidas Pela deleção gênica de uma região
Do DNA bacteriano de certas espécies bacterianas Como Salmonella Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Listeria monocytogenes A deleção gênica atrapalha a fissão binária bacteriana E ao invés da bactéria produzir Duas células filhas Elas produz minicélulas Com aproximadamente 400 nm de diâmetro

78 Macdiarmid e colaboradores, 2007
Desenvolveram um conjugado de Minicélulas Carreando RNAi Para o gene responsável pela Resistência ao quimioterápico Carrearia a droga Ambas as minicélulas teriam em sua membrana Receptores bi-expecíficos Que se ligariam a parede bacteriana A célula tumoral. Essas minicélulas ligaram-se ao tumor E reduziram a massa tumoral Nos modelos in vivo Aumentando a sobrevida desses modelos No ano de 2007, MacDiarmid e colaboradores utilizando minicélulas, desenvolveram um sistema de dupla entrega. A minicélula conteria além do quimioterápico utilizado para o tratamento tumoral, um anticorpo bi-específico que se ligaria no lipopossicarídeo-O do LPS da minicélula e outra região que se ligaria diretamente em receptores de membrana da célula tumoral (MacDiarmid et al. 2007a). Essas minicélulas seletivamente ligaram-se ao câncer estabilizando o crescimento e diminuição da massa tumoral nos modelos in vivo (MacDiarmid et al. 2007a; MacDiarmid et al. 2007b; MacDiarmid et al. 2009).

79 Além disso, Os autores demonstraram que
Cada minicélula abriga em seu interior Até moléculas de RNAi Que é cerca de 10x mais o que abriga um Nanovetor comum Os mesmos autores em outro estudo Também verificaram que, Minicélulas contendo até 100 cópias de um plasmídio que codifica RNAi para EGFR Os camundongos tiveram seus tumores diminuídos permacendo saudáveis até 110 dias após a injeção de minicélulas+RNAi Com isso os autores demonstraram que Minicélulas conjugadas São ótimas ferramentas para A terapia antitumoral Apesar das minicélulas serem delimitadas por uma membrana lipídica, MacDiarmid e colaboradores demonstraram que cada minicélula pode abrigar aproximadamente moléculas de RNAi (MacDiarmid et al. 2009). Embora o mecanismo de carreamento ainda permaneça obscuro, os autores observaram que as minicélulas contendo RNAi para o fator de crescimento epidérmico (EGRF) foram internalizadas pelas células por endocitose e o RNAi foi liberado no citoplasma das células neoplásicas. Semelhantes resultados foram obtidos utilizando minicélulas contendo aproximadamente 100 cópias de um plasmídio que codifica RNAsh para o mesmo RNAm. Utilizando essa técnica, os autores reportaram que após 110 dias de implante tumoral 100% dos camundongos estavam saudáveis. Dessa forma, o trabalho realizado por MacDiarmid e colaboradores tornaram-se eficazes na entrega de RNAi em células neoplásicas, além do que melhoraram o quadro clínico dos camundongos transplantados com células tumorais (Karagiannis et al. 2009). Assim, desenvolveremos em nosso laboratório montado com o financiamento deste projeto, uma minicélula um pouco diferente da descrita por MacDiarmid, porque além de ser feita pela deleção gênica do complexo gênico MinCDE, também carreará um duplo conjugado para se ligar a membrana da minicélula e ao tumor, sendo internalizado por este, e fazendo com que este entre em apoptose.

80 CONCLUINDO… Investir em nanotecnologia Significa investir
Em equipamentos Vetores Drogas Tecnologias Que diagnosticarão Tratarão Mais fidedignamente As neoplasias malignas

81 OBRIGADO!!!!