Idéias, Possíveis projetos de Pós-Doutoramento, Brain Storm Jorge Mondego Dezembro/2005.

Apresentação em tema: "Idéias, Possíveis projetos de Pós-Doutoramento, Brain Storm Jorge Mondego Dezembro/2005."— Transcrição da apresentação:

1 Idéias, Possíveis projetos de Pós-Doutoramento, Brain Storm Jorge Mondego Dezembro/2005

2 Patógenos BiotróficosPatógenos Necrotróficos Crinipellis perniciosa JA Via dos octadecanóides COI1 AtMYC2 ERF1 WRKY70 SA NPR1 Ca2+/NO/ROS HR (PCD) Genes R Resposta a patógenos via SA p.e – PR-1, PR-2, PR-5, PR-7 Resposta a patógenos via JA/etileno p.e – defensina PDF1.2, etc. Resposta a ferida via JA/ABA p.e – VSP, PIN, LAP, LOX, etc ABA AOX, Catalase NEP (oxalato decarboxilase ?) Oxalato de cálcio H2O2 PCD Ca2+ Etileno bZIP/TGA Fatores responsivos a Auxina X Ferida Figueira et al., 2005 QTL

3 - Idéias para futuros projetos - “Possível” projeto de pós-doutoramento - Sugestões, opiniões - Brain Storm sobre projetos em andamento

4 Caracterização da expressão gênica de Crinipellis perniciosa em diferentes condições de crescimento Análise das bibliotecas de subtração – complexidade, redundância, comparação dos genes em cada biblioteca Análise dos microarranjos – Hibridação nos slides, coleta e análise de dados (Ludwig ?)

5 Caracterização da maquinaria de SiRNA em Crinipellis perniciosa Silenciamento de RNA - PTGS, Quelling, RNAinterference – dsRNA MicroRNA – Regulação de genes endógenos – desenvolvimento e diferenciação celular - Alguns No Hits são MicroRNAs - Existem microRNAs em fungos ? (Kadotani et al., 2004) Formação de heterocromatina e repressão de elementos transponíveis (TGS) – S. pombe e plantas Idéia – vasculhar genes envolvidos com siRNA e regulação gênica via RNA no banco de dados CP e cacau -Possíveis colaborações – Tiago Pereira (FCM), Fabio Nogueira (CSHL)

6 Caracterização de proteínas extracelulares secretadas na fase biotrófica de Crinipellis perniciosa com atividade de protease e inibidor de protease Biotrofia – Suprimir defesas do vegetal (Grupo de PTNS que ajudam na infecção e na supressão das defesas do hospedeiro). Como um patógeno consegue viver no apolasto ? – poucos nutrientes, ambiente inóspito (proteínas de defesa vegetal – quitinase, glucanase, proteases - PR7) Expressão de proteínas supressoras de defesa: -Anti-oxidação e turnover metabólico – AOX, p.e -Proteases – Clivam proteínas de defesa vegetal -Inibidores de protease (IPs) – Inibem proteases do hospedeiro - Phytophthora spp., Cladosporum fulvum

7 Proteínas Kazal Tian et al., 2004 e 2005 1- Identificado um IP serínico da classe Kazal que interage diretamente com uma protease serínica do tipo subtilisina vegetal durante a infestação por Phytophthora infestans; 2- Asp no resíduo P1. Seria Epi1 um inibidor de Saspase (PCD)? Supressão de morte celular programada da planta manteria célula viva, propiciando o desenvolvimento do oomiceto biotrófico na planta. A priori – Clonar e caracterizar genes de CP que codificam proteínas Kazal Não achei proteínas Kazal no banco de dados CP

8 Caracterização de proteínas extracelulares secretadas na fase biotrófica de Crinipellis perniciosa com atividade de protease e inibidor de protease Análise das proteínas presentes no meio extracelular de CP na fase biotrófica PAGE – Ensaio enzimático proteolítico e de inibição de proteólise Análise da(s) banda(s) – 2D, MS/MS, seqüenciamento N-terminal Possíveis colaboradores: UESC, Marcos Eberlin (Lab Thomson), Fabio Gozzo (LNLS), Camilo (LAQUIP), Maria Tanaka (UNIFESP) Clonagem do geneExpressão da proteínaImobilização em coluna Fluido apoplástico cacauPull Down Seqüenciamento N-terminal MS/MS

9 Caracterização da proteína do tipo taumatina de Crinipellis perniciosa Taumatina-like (PR-5): Proteínas de plantas que desestabilizam membranas fúngicas, se ligam e hidrolizam β-1,3-glucanas fúngicas Encontradas em Schistocerca gregaria, C. elegans, nos basidiomicetos Cryptococcus neoformans, Pleurotus eryngii e nos conídios de Aspergillus nidulans Osmotina – PR-5 de tabaco. Induz PCD em S. cerevisae. Se liga a receptor de adiponectina de mamíferos Existem proteínas similares a receptores de adiponectina em plantas Qual a “função” de uma taumatina em um fungo fitopatogênico? -Evitar colonização de outros fungos na vassoura ??? -Estimular PCD em plantas ??????

10 Caracterização da proteína do tipo taumatina de Crinipellis perniciosa Clonagem (RACE-PCR) Expressão da proteína Testes antifúngicos Testes in planta Anticorpos (Luiz Perone, Profa Dagmar) Transformação em Arabidopsis Sistema de expressão induzível (GR-dexametasona) Possível colaborador: Michel Vincentz Proteína “complicada” – pontes disulfeto Tentar vários plasmídeos e hospedeiros (E. coli, Aspergillus, Pichia, Baculo) Expressão em CP (B/T) Expressão durante infestação

11 Medição de fitohormônios e enzimas durante a infestação de Crinipellis perniciosa Fitohormônios regulam mecanismos de desenvolvimento e defesa Aumento da auxina (?) – Hipertrofia (alongamento celular, retardo da abscisão foliar, altos níveis induzem produção de etileno, formação de frutos partenocárpicos) Grãos de amido “somem” durante infestação – Medição de alfa-amilase - Medir Ácido salicílico (SA), Ácido jasmônico (JA/MeJA) e octadeconóides (OPDA) Ácido abscísico (ABA), Auxinas, Citocininas, Brassinoesteróides Colaborador: Paulo Mazzafera

12 Fisiologia, anatomia e bioquímica do roletamento Roletamento – Corte ao longo do tronco – rompimento do floema – reconstituição após 40 dias. Antecipação do florescimento (2 meses após corte) Sinal “deve ser” transmitido do sítio de ferimento até “gemas florais” Sinal interno e/ou externo (?) – Ferimento induz liberação de voláteis (terpenóides, hexenos, etileno, MeJA). Alguns artigos indicam que MeJA e etileno regulam positivamento o desenvolvimento floral Idéia 1 – Sinal externo Medição dos voláteis liberados após ferimento, avaliar adiantamento da floração por ferimento, verificar se voláteis induzem floração em plantas vizinhas (espécie –específico ?) Idéia 2 – Sinal interno (?) Sistemina Receptor de regulação floral Colaborador: Paulo Mazzafera, Marcelo Dornelas, Michel Vincentz

13 7 - Por que Crinipellis infecta somente tecidos meristemáticos? X Quimiotaxia ? Proteínas receptoras específicas de tecidos meristemáticos ?

14 8 – Brain Storm Bibliotecas AOX NEP