DETERMINAÇÃO DO POTENCIAL ANTIFÚNGICO POR BIOCONTROLADORES, UTILIZANDO MÉTODOS ANALÍTICOS E CULTIVO PAREADO. Engenharia Química: Processos Bioquímicos. Lidiane Milanez Daminelli (IC) Dile Pontarolo Stremel (PQ) PMUC – Prêmio Mérito Universitário Grupo de pesquisa em Engenharia de Processos Curso de Engenharia Química (EQM), Campus Tubarão. Introdução É crescente o número de estudos e experimentos na área de biotecnologia nestes últimos anos mostrando tal desenvolvimento desta área. Dentre os inúmeros processos biotecnológicos destacam-se a produção de biocontroladores de pragas agrícolas, conhecidos como biofungicidas, bioinseticidas, dentre outros. De acordo com Brock (1976), a produção de antibióticos está relacionada, na maioria dos casos, com o processo de esporulação, sendo liberado o antibiótico quando o cultivo entra na fase estacionária de desenvolvimento e depois que começa a esporulação. A resistência dos metabólitos produzidos por Bacillus subtilis ao calor, e a formação de endósporos altamente resistentes, são características excelentes para o desenvolvimento comercial de formulações desta bactéria, Melo & Sanhueza (1995). Uma classe de substâncias com potencial antimicrobiano produzido por B. subtilis são as bacitracinas. As preparações comerciais são uma mistura de pelo menos nove tipos, sendo a bacitracina A o constituinte em maior quantidade (PRICE et al., 2007). Uma das metodologias que está sendo desenvolvida, especialmente na quantificação dos compostos ativos é a espectroscopia na região do infravermelho, utilizando a técnica de calibração multivariada. Esta metodologia tem sido cada vez mais usada como ferramenta analítica nas indústrias de alimentos e agrícola. A calibração multivariada é uma ferramenta matemática muito utilizada na química analítica. Faz uso de uma matriz de dados que quando aplicada a um método específico (como o PCR – Principal Component Regression ou o PLS – Partial Least Squares), lida com os ruídos experimentais, a colinearidade e não-linearidade dos dados obtidos, para gerar dados mais eficientes e que levem a informações de mais rápida e precisa interpretação (FERREIRA et al., 1999). A utilização desta ferramenta na quantificação dos compostos de interesse produzidos pelo micro-organismo, diretamente no meio de fermentação forneceria dados importantes, mesmo durante o processo fermentativo. Objetivos Identificar a espécie Bacillus PR29 cedida, avaliar o efeito antifúngico por diferentes formulações, definir uma composição partindo de resíduos agroindustriais e estudar uma metodologia de quantificação de princípios ativos. Metodologia Identificação do Bacillus spp Para identificar a espécie com objetivo de garantir a qualidade, foi solicitado à Cyrbe do Brasil Ltda. um relatório técnico com informações relavantes para a taxonomia, empregando a metodologia convencional e complementação de testes com kits de identificação do sistema API 50 CHB e sistema API 20 E (Bio Mérieux). Cultivo Pareado: Testes de Inibição Fúngica Para o doseamento de bacitracina, foram feitos formulados para serem utilizados no desenvolvimento da metodologia de calibração, juntamente com amostras comerciais da biocontrol da Cyrbe do Brasil. Os formulados foram desenvolvidos de acordo com as composições otimizadas em trabalho de Silveira (2008).Foram aplicando 3 fatores (Melado, Soro, Efluente de parboilização), Espectroscopia na região do infravermelho Um conjunto de calibração contendo 30 amostras, soluções de diferentes concentrações de bacitracina (10 g/ml a 200 g/ml), será preparado. Espectros na região do infravermelho do conjunto de calibração serão registrados na faixa espectral de 7000 a 400 cm -1 utilizando-se resolução 4 a 128 scans. Os espectros serão processados para a obtenção dos modelos multivariados considerando toda a faixa espectral obtida pelo equipamento, regiões do infravermelho médio (4000 a 400 cm-1), do infravermelho próximo (7000 a 4000 cm-1) e determinadas regiões espectrais específicas que sejam características do antibiótico bacitracina. Resultados Halo de inibição após 7 dias de crescimento para o formulado otimizado a base de 5% de soro e 25% de efluente de parboilização. Diâmetro máximo de crescimento do fungo de 2,0 cm Resultados a serem obtidos por Calibração Multivariada – Modelamento e validação O modelo multivariado de calibração será desenvolvido por uma rotina de regressão de mínimos quadrados parciais (PLSR), utilizando-se o programa PLS-toolbox 1.5, que opera em ambiente MATLAB 4.2. Para otimização do número de variáveis latentes será utilizada a rotina de validação cruzada denominada leave-one-out. Neste procedimento, as amostras que fazem parte do conjunto de calibração são retiradas, uma a uma, para serem utilizadas como elementos de previsão. Em geral, estima-se que o melhor número de variáveis latentes é aquele que proporciona o menor valor para a somatória dos quadrados dos erros de previsão (PRESS) (FERREIRA et al., 1999). A presença de anomalias no conjunto de calibração será avaliada por meio das grandezas leverage e resíduos de Student. Considerando-se uma distribuição normal e um nível de confiança de 95%, o valor limite para o parâmetro de Student corresponde a ±2,5%. O valor máximo permitido para o parâmetro “leverage” é obtido pela expressão 3VL/n, em que VL corresponde ao número de variáveis latentes (componentes principais) e “n” ao número de amostras utilizadas. A exatidão será realizada pelo ensaio de recuperação, a partir de amostras nas quais foram incorporadas quantidades conhecidas de bacitracina no filtrado do meio de fermentação e ensaios de precisão. Os resultados serão comparados estatisticamente através da análise de variância ANOVA para comparação entre os grupos e teste de Tukey para comparação entre médias, ao nível de significância de 5%, utilizando programa Microsoft Excel. Teste de Wilcoxan para análises não paramétricas com menor valor de n, considerando p < 0,05, utilizando o software SPSS for Windows. Conclusões Este trabalho tem como maior valia a confirmação da produção da bacitracina pelo Bacilus subtillis, os métodos analíticos vieram para quantificação do mesmo. Numa proposta futura estes métodos serão implementados por outra pesquisadora. A realização deste trabalho em parceria com a Universidade Federal do Paraná firmou uma grande parceria entre universidades. Bibliografia BROCK, T.D. Biologia dos Microorganismos. Prenctice Hall, inc, p , SILVEIRA, D. R. ; STREMEL, D. P.. Avaliação de Biocontroladores Fitopatogênicos Através de Métodos In Vitro. In: III Unisul Contexto e III Jornada Unisul de Iniciação Científica - III Junic, 2008, Tubarão-SC. III Junic e III Seminário de Pesquisa Tubarão : Universidade do Sul de Santa Catarina, Apoio Financeiro: Unisul