UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA DISCIPLINA: BIOQUÍMICA FISIOLÓGICA–BQA5110 Aula Prática 03: Determinação de carboidratos redutores totais no mel Alunos: Bruno Mattei Fábio César da Silva Fábio César da Silva Tatiana de Oliveira Remor Tatiana de Oliveira Remor Florianópolis, 20 de novembro de 2008

Aula Prática 03: Determinação de carboidratos redutores totais no mel Realização de uma pesquisa bibliográfica sobre determinação de carboidratos redutores totais no mel Realização de uma pesquisa bibliográfica sobre determinação de carboidratos redutores totais no mel Avaliação dos resultados obtidos na aula prática Avaliação dos resultados obtidos na aula prática Responder às questões referentes ao tema estudado: Responder às questões referentes ao tema estudado: 1) Citar a composição qualitativa (tipos de carboidratos encontrados) e quantitativa (concentração) de três diferentes tipos de mel, mencionando a(s) respectivas característica (s). 1) Citar a composição qualitativa (tipos de carboidratos encontrados) e quantitativa (concentração) de três diferentes tipos de mel, mencionando a(s) respectivas característica (s). 2) Por que o resultado é expressado em “carboidratos redutores totais”, apesar de ser usada a curva de calibração de glicose. 2) Por que o resultado é expressado em “carboidratos redutores totais”, apesar de ser usada a curva de calibração de glicose. 3) Procurar interferentes para técnica, reações cruzadas, especificidade. 3) Procurar interferentes para técnica, reações cruzadas, especificidade. 4) Indicar possíveis causas para os diferentes resultados encontrados entre as equipes. 4) Indicar possíveis causas para os diferentes resultados encontrados entre as equipes.

Introdução O que é o mel? O que é o mel? “Mel é um alimento, geralmente encontrado em estado líquido viscoso e açucarado, que é produzido pelas abelhas a partir do néctar recolhido de flores e processado pelas enzimas digestivas desses insetos, sendo armazenado em favos em suas colmeias para servir-lhes de alimento.” (Muñoz, O. et al., 2007) “Mel é um alimento, geralmente encontrado em estado líquido viscoso e açucarado, que é produzido pelas abelhas a partir do néctar recolhido de flores e processado pelas enzimas digestivas desses insetos, sendo armazenado em favos em suas colmeias para servir-lhes de alimento.” (Muñoz, O. et al., 2007) O mel tem sido utilizado pelo homem há muito tempo, seja como alimento ou como medicamento, devido às suas propriedades anti-sépticas e, ainda, como conservante. O mel tem sido utilizado pelo homem há muito tempo, seja como alimento ou como medicamento, devido às suas propriedades anti-sépticas e, ainda, como conservante. O mel puro deve apresentar aspecto translúcido com uma cor que poderá variar do branco incolor ao castanho escuro, com cheiro e sabor característico, com variedades próprias relacionados aos tipos de mel. O mel puro deve apresentar aspecto translúcido com uma cor que poderá variar do branco incolor ao castanho escuro, com cheiro e sabor característico, com variedades próprias relacionados aos tipos de mel.

Existem inúmeras variedades de mel, estando estas relacionadas com a espécie de abelhas produtoras do mel, as flores produtoras de néctar (podendo o mel ser monofloral ou plurifloral), a climatização da região de produção e o tempo de amadurecimento do mel, entre outros fatores. Existem inúmeras variedades de mel, estando estas relacionadas com a espécie de abelhas produtoras do mel, as flores produtoras de néctar (podendo o mel ser monofloral ou plurifloral), a climatização da região de produção e o tempo de amadurecimento do mel, entre outros fatores. Em relação à tonalidade, são reconhecidos como principais comercialmente 5 variedades de mel: branco, âmbar (amarelo), dourado, vermelho e pardo (castanho). Quanto mais escuro o mel, mais forte seu aroma e seu sabor, bem como a concentração de sais minerais. Em relação à tonalidade, são reconhecidos como principais comercialmente 5 variedades de mel: branco, âmbar (amarelo), dourado, vermelho e pardo (castanho). Quanto mais escuro o mel, mais forte seu aroma e seu sabor, bem como a concentração de sais minerais. Em geral, o mel é constituído por cerca de 75% de carboidratos (principalmente glicose e frutose), 20% de água, por minerais (cálcio, cobre, ferro, magnésio, fósforo, potássio, entre outros), por cerca de metade dos aminoácidos existentes, por ácidos orgânicos (ácido acético, ácido cítrico, entre outros) e por vitaminas do complexo B, por vitamina C, D e E. O mel possui ainda um teor considerável de antioxidantes (flavonóides e fenólicos). Em geral, o mel é constituído por cerca de 75% de carboidratos (principalmente glicose e frutose), 20% de água, por minerais (cálcio, cobre, ferro, magnésio, fósforo, potássio, entre outros), por cerca de metade dos aminoácidos existentes, por ácidos orgânicos (ácido acético, ácido cítrico, entre outros) e por vitaminas do complexo B, por vitamina C, D e E. O mel possui ainda um teor considerável de antioxidantes (flavonóides e fenólicos). Introdução

Dentre os componentes do mel estão como principais os carboidratos glicose e frutose, dois monossacarídeos. Esses monossacarídeos são açúcares redutores por possuírem grupo carbonílico e/ou cetônico livres, capazes de se oxidarem na presença de agentes oxidantes em soluções alcalinas. Dentre os componentes do mel estão como principais os carboidratos glicose e frutose, dois monossacarídeos. Esses monossacarídeos são açúcares redutores por possuírem grupo carbonílico e/ou cetônico livres, capazes de se oxidarem na presença de agentes oxidantes em soluções alcalinas. O Ministério da Agricultura e do Abastecimento (Brasil, 2000) exige um mínimo de açúcares redutores de 65%, para méis de flores. O Ministério da Agricultura e do Abastecimento (Brasil, 2000) exige um mínimo de açúcares redutores de 65%, para méis de flores. Em 13/08/96, foram concluídos ensaios em 12 marcas em mel de abelha das seguintes regiões: Paraná, Piauí, Rio de Janeiro, Santa Catarina, São Paulo, Rio Grande do Sul e Argentina. Todas as amostras ensaiadas foram aprovadas nos ensaios físico-químicos. (INMETRO, 1996) Em 13/08/96, foram concluídos ensaios em 12 marcas em mel de abelha das seguintes regiões: Paraná, Piauí, Rio de Janeiro, Santa Catarina, São Paulo, Rio Grande do Sul e Argentina. Todas as amostras ensaiadas foram aprovadas nos ensaios físico-químicos. (INMETRO, 1996) Estes ensaios realizados incluiram carboidratos redutores totais. Estes ensaios realizados incluiram carboidratos redutores totais. Introdução

Introdução

Disssacarídeo importante em alimentos, inclusive no mel, a Sacarose não é um açucar redutor, devido ao comprometimento dos carbonos anoméricos de sua frutose e glicose constituintes. A ligação que compromete suas funções anoméricas, entretanto, é relativamente lábil, e ao ser hidrolisada em meio ácido libera glicose e frutose, que são redutoras. Se não houver a adição prévia de um ácido suficientemente forte para a hidrolisação da ligação glicose + frutose, entretanto a sacarose não apresenta potencial redutor, e não seria um interferente. Disssacarídeo importante em alimentos, inclusive no mel, a Sacarose não é um açucar redutor, devido ao comprometimento dos carbonos anoméricos de sua frutose e glicose constituintes. A ligação que compromete suas funções anoméricas, entretanto, é relativamente lábil, e ao ser hidrolisada em meio ácido libera glicose e frutose, que são redutoras. Se não houver a adição prévia de um ácido suficientemente forte para a hidrolisação da ligação glicose + frutose, entretanto a sacarose não apresenta potencial redutor, e não seria um interferente. Alguns dissacarideos, diferentemente da sacarose, apresentam potencial redutor, como é o caso da maltose. A extremidade anomérica da maltose pode ser considerada um carboidrato livre, como os monossacarídeos. Alguns dissacarideos, diferentemente da sacarose, apresentam potencial redutor, como é o caso da maltose. A extremidade anomérica da maltose pode ser considerada um carboidrato livre, como os monossacarídeos. Introdução

Glicoses e frutoses, em solução se interconvertem entre cadeias abertas e fechadas, e possuem a hidroxila do carbono anomérico livre e portanto, possuem poder redutor. Além do mais, pode ocorrer interconversão entre glicoses e frutoses. Glicoses e frutoses, em solução se interconvertem entre cadeias abertas e fechadas, e possuem a hidroxila do carbono anomérico livre e portanto, possuem poder redutor. Além do mais, pode ocorrer interconversão entre glicoses e frutoses. É por este motivo, e também pelo fato que cada monossacarídeo reduz uma unidade básica igual de íons como o cobre em meio alcalino que é possível, na avaliação de carboidratos redutores totais no mel, ser realizada uma comparação com uma curva padrão de glicose, apenas, e não é necessário uma curva de carboidratos redutores totais, já que cada frutose equivaleria em potencial redutor a uma glicose. É por este motivo, e também pelo fato que cada monossacarídeo reduz uma unidade básica igual de íons como o cobre em meio alcalino que é possível, na avaliação de carboidratos redutores totais no mel, ser realizada uma comparação com uma curva padrão de glicose, apenas, e não é necessário uma curva de carboidratos redutores totais, já que cada frutose equivaleria em potencial redutor a uma glicose. Além do mais, a massa molecular da glicose e da frutose é a mesma, fazendo com que a massa equivalente de glicose possa ser expressa em massa equivalente de frutose e vice-versa Além do mais, a massa molecular da glicose e da frutose é a mesma, fazendo com que a massa equivalente de glicose possa ser expressa em massa equivalente de frutose e vice-versa Introdução

Introdução Massa molecular da glicose = massa molecular da frutose

Introdução

Tipos de mel: Tipos de mel: 5 diferentes méis produzidos no estado do Piauí foram analisados, sendo estes elaborados de diferentes floras. São elas: marmeleiro (Croton sonderianus Mull. Arg.); silvestre (Serjania glabrata); angico de bezerro (Piptadenia moniliformis); jitirana (Hyptis suaveolens); e camaratuba (Cratylia mollis Mart. ex Benth). 5 diferentes méis produzidos no estado do Piauí foram analisados, sendo estes elaborados de diferentes floras. São elas: marmeleiro (Croton sonderianus Mull. Arg.); silvestre (Serjania glabrata); angico de bezerro (Piptadenia moniliformis); jitirana (Hyptis suaveolens); e camaratuba (Cratylia mollis Mart. ex Benth). Analises das amostras de mel mostraram que, dentre outros componentes, a umidade, os açucares redutores, a sacarose aparente, a acidez livre e o pH apresentaram diferenças significativas, denotando-se a influencia que as espécies florais tiveram sobre o nível desses. Analises das amostras de mel mostraram que, dentre outros componentes, a umidade, os açucares redutores, a sacarose aparente, a acidez livre e o pH apresentaram diferenças significativas, denotando-se a influencia que as espécies florais tiveram sobre o nível desses. Apesar destas diferenças, todos os tipos de mel encontran-se enquadrados nos padrões estabelecidos pelo Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Apesar destas diferenças, todos os tipos de mel encontran-se enquadrados nos padrões estabelecidos pelo Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Nas analises dos níveis de açucares redutores, notamos como maiores e menores valores encontrados os de 85,49% (silvestre) e 68,92% (marmeleiro), sendo que o mínimo exigido de açucares redutores no mel é de 65%. Nas analises dos níveis de açucares redutores, notamos como maiores e menores valores encontrados os de 85,49% (silvestre) e 68,92% (marmeleiro), sendo que o mínimo exigido de açucares redutores no mel é de 65%. Introdução

Introdução

Experiência: Determinação de carboidratos redutores totais no mel Introdução

Justificativa: Justificativa: Quando se analisa amostras de mel, é comum encontrar variações na sua composição química, tendo em vista que variados fatores interferem na sua qualidade, como condições climáticas, espécie de abelha, processamento e armazenamento, entre outros. A avaliação de carboidratos redutores tem sua importância vinculada à necessidade de avaliação do valor nutricional do mel bem como a manutenção de suas características organolépticas. Quando se analisa amostras de mel, é comum encontrar variações na sua composição química, tendo em vista que variados fatores interferem na sua qualidade, como condições climáticas, espécie de abelha, processamento e armazenamento, entre outros. A avaliação de carboidratos redutores tem sua importância vinculada à necessidade de avaliação do valor nutricional do mel bem como a manutenção de suas características organolépticas. Objetivo: Objetivo: Determinar as concentrações de carboidratos redutores totais presentes em amostras de mel Determinar as concentrações de carboidratos redutores totais presentes em amostras de mel Introdução

Materiais Materiais Solução estoque de glicose 1% em solução saturada de ácido benzóico (conservante) Solução estoque de glicose 1% em solução saturada de ácido benzóico (conservante) Solução padrão de glicose 100 µg/mL : preparada a partir da solução estoque de glicose 1% Solução padrão de glicose 100 µg/mL : preparada a partir da solução estoque de glicose 1% Solução alcalina (200 g de sulfato de sódio anidro, 25g de tartarato de sódio e potássio, 25g de carbonato de sódio anidro, 20g de bicarbonato de sódio, completado até 1000 mL de água) Solução alcalina (200 g de sulfato de sódio anidro, 25g de tartarato de sódio e potássio, 25g de carbonato de sódio anidro, 20g de bicarbonato de sódio, completado até 1000 mL de água) Solução cúprica (15g de sulfato de cobre cristalizado, 1 gota de ácido sulfúrico concentrado, completar para 100 mL de água) Solução cúprica (15g de sulfato de cobre cristalizado, 1 gota de ácido sulfúrico concentrado, completar para 100 mL de água) Solução cupro-alcalina : 24 volumes de sol. Alcalina + 1 volumes de Sol. Cuprica Solução cupro-alcalina : 24 volumes de sol. Alcalina + 1 volumes de Sol. Cuprica Solução molibdica (66g de molibdato de sódio, 5g de tungstato de sódio, 125 mL de ácido fosfórico – 85%, completar para 500 mL de água) Solução molibdica (66g de molibdato de sódio, 5g de tungstato de sódio, 125 mL de ácido fosfórico – 85%, completar para 500 mL de água) Materiais e métodos

Métodos Métodos Reação com íons de cobre – formação de complexos cromóforos Reação com íons de cobre – formação de complexos cromóforos Carboidratos que possuem grupos aldeídos ou cetol livres ou potencialmente livres apresentam a propriedade de reduzir os íons de certos metais como cobre, por exemplo, especialmente em soluções alcalinas. Alguns dos métodos mais amplamente usados para avaliação química de carboidratos redutores baseiam-se nessa propriedade. Carboidratos que possuem grupos aldeídos ou cetol livres ou potencialmente livres apresentam a propriedade de reduzir os íons de certos metais como cobre, por exemplo, especialmente em soluções alcalinas. Alguns dos métodos mais amplamente usados para avaliação química de carboidratos redutores baseiam-se nessa propriedade. O cobre, sob forma de íons cúpricos, é usado preferencialmente, devido à facilidade de leitura pelo método fotométrico O cobre, sob forma de íons cúpricos, é usado preferencialmente, devido à facilidade de leitura pelo método fotométrico Quando o hidróxido cúprico (azul e insolúvel) é suspenso em meio alcalino e aquecido, converte-se em óxido cúprico (preto e insolúvel): Quando o hidróxido cúprico (azul e insolúvel) é suspenso em meio alcalino e aquecido, converte-se em óxido cúprico (preto e insolúvel): Materiais e métodos

Na presença de substâncias redutoras como aldeídos e carboidratos, no entanto, o hidróxido cúprico é reduzido até o estado de oxido cuproso (amarelo e vermelho); também insolúvel: Na presença de substâncias redutoras como aldeídos e carboidratos, no entanto, o hidróxido cúprico é reduzido até o estado de oxido cuproso (amarelo e vermelho); também insolúvel: A quantidade de óxido cuproso formado é essencialmente proporcional à quantidade de carboidrato redutor existente na solução em análise desde que se sigam rigorosamente as especificações e procedimentos recomendados. Neste método a quantidade de óxido cuproso formado por redução das soluções cupro- alcalinas é avaliado por meio de técnicas fotocolorimétricas, que medem a intensidade da cor azul (azul de molibdênio), uma mistura complexa de óxidos de molibdênio, que se forma quando se trata o óxido cuproso com reagentes molibdicos, e que é soluvel, podendo ser medida pelo fotocolorímetro. A quantidade de óxido cuproso formado é essencialmente proporcional à quantidade de carboidrato redutor existente na solução em análise desde que se sigam rigorosamente as especificações e procedimentos recomendados. Neste método a quantidade de óxido cuproso formado por redução das soluções cupro- alcalinas é avaliado por meio de técnicas fotocolorimétricas, que medem a intensidade da cor azul (azul de molibdênio), uma mistura complexa de óxidos de molibdênio, que se forma quando se trata o óxido cuproso com reagentes molibdicos, e que é soluvel, podendo ser medida pelo fotocolorímetro. Materiais e métodos

Praticamente qualquer substância redutora ou oxidante pode interferir neste método!!! Praticamente qualquer substância redutora ou oxidante pode interferir neste método!!! Como no mel existem inúmeras substâncias com propriedades redox, é possível que estas interfiram e dêem tanto resultados falso-positivos quanto resultados falso-negativos. Alguns exemplos de substâncias interferentes são: sais minerais em excesso(cobre e ferro), flavonóides, compostos fenólicos, vitamina C, entre outros. Sacaroses que sofrerem hidrolisação também podem aumentar a concentração de glicose e frutose em solução, mesmo a sacarose em si não sendo um carboidrato redutor Como no mel existem inúmeras substâncias com propriedades redox, é possível que estas interfiram e dêem tanto resultados falso-positivos quanto resultados falso-negativos. Alguns exemplos de substâncias interferentes são: sais minerais em excesso(cobre e ferro), flavonóides, compostos fenólicos, vitamina C, entre outros. Sacaroses que sofrerem hidrolisação também podem aumentar a concentração de glicose e frutose em solução, mesmo a sacarose em si não sendo um carboidrato redutor Alguns interferentes podem também não estar presentes no mel e sim no ambiente onde ocorre a reação, como no tubo reacional, nas pipetas utilizadas, na água usada na preparação dos reagentes, entre outros. Alguns interferentes podem também não estar presentes no mel e sim no ambiente onde ocorre a reação, como no tubo reacional, nas pipetas utilizadas, na água usada na preparação dos reagentes, entre outros. Materiais e métodos

É interessante ressaltar que esta técnica depende da calibração do fotocolorímetro, que pode interferir significativamente nos resultados obtidos. É interessante ressaltar que esta técnica depende da calibração do fotocolorímetro, que pode interferir significativamente nos resultados obtidos. Analise estatística: os resultados obtidos foram analisados pelo teste Q com intervalo de confiança de 95% (Q 0,95), sendo utilizados os resultados de 8 grupos. Os resultados foram expressos em forma de gráfico por um programa específico. Analise estatística: os resultados obtidos foram analisados pelo teste Q com intervalo de confiança de 95% (Q 0,95), sendo utilizados os resultados de 8 grupos. Os resultados foram expressos em forma de gráfico por um programa específico. Materiais e métodos

Procedimento Experimental BrancoAmostra P1 (25µg/ mL) P2 (50µg/ mL) P3 (75µg/ mL) P4 (100µg/ mL) Sol. Padrão (100µg/mL) -- 0,25 mL 0,50 mL 0,75 mL 1,0 mL Amostra (dil. 1:6000) - 0,5 mL ---- Água destilada 1,0 mL 0,5 mL 0,75 mL 0,50 mL 0,25 mL - Sol. Cupro- alcalina 1,0 mL

Procedimento Experimental Depois de homogeinizados, foram deixados em banho maria fervente por 10 minutos. Depois de homogeinizados, foram deixados em banho maria fervente por 10 minutos. Após este tempo, foram retirados e resfriados em água corrente. Após este tempo, foram retirados e resfriados em água corrente. Foi adicionado 1 mL de sol. Molibdíca em cada tubo, em seguida diluindo para 5,0 mL. Foi adicionado 1 mL de sol. Molibdíca em cada tubo, em seguida diluindo para 5,0 mL. Em seguida foi realizada uma leitura no fotocolorímetro no comprimento de onda de 520 nm. O tubo Branco foi utilizado para zerar o aparelho. Em seguida foi realizada uma leitura no fotocolorímetro no comprimento de onda de 520 nm. O tubo Branco foi utilizado para zerar o aparelho. A curva foi montada com as soluções Padrão (P1, P2, P3 e P4). A curva foi montada com as soluções Padrão (P1, P2, P3 e P4). A amostra foi lida e as absorbâncias, anotadas. A amostra foi lida e as absorbâncias, anotadas.

Resultados e discussão P1P2P3P4Amostra Eq. 1 0,0280,0890,1440,2130,115 Eq. 2 0,0260,0940,1650,2540,168 Eq. 3 0,0890,2040,3730,5100,055 Eq. 4 0,0300,0580,1100,1550,076 Eq. 5 0,0160,0680,1070,1630,101 Eq. 6 0,0500,0780,1540,1920,158 Eq. 7 0,0840,2030,3540,4770,097 Eq. 8 0,0410,1150,1740,2250,087

Resultados e discussão Nenhum resultado foi descartado pelo teste Q com intervalo de confiança de 95% (Q 0,95). Nenhum resultado foi descartado pelo teste Q com intervalo de confiança de 95% (Q 0,95). O resultado de média ± desvio padrão da média de cada valor da curva padrão de glicose e das amostras está sendo expresso a seguir: O resultado de média ± desvio padrão da média de cada valor da curva padrão de glicose e das amostras está sendo expresso a seguir: []Média Desvio Padrão 25 µg/mL 0,0450, µg/mL 0,1140, µg/mL 0,1980, µg/mL 0,2740,140 Amostra0,1070,039

Resultados e discussão

Concentração de glicose (carboidratos redutores) definida pela equação da reta: 41,15 µg/mL Obs: R² considerado baixo; ideal = >0,99

Resultados e discussão 41,15 µg de glicose – 0,5 mL de amostra diluida 41,15 µg de glicose – 0,5 mL de amostra diluida µg de glicose – 6000 mL de amostra diluida µg de glicose – 6000 mL de amostra diluida (1g de mel diluido em 6000 mL de água) (1g de mel diluido em 6000 mL de água) 0, g de glicose – 1g de mel 0, g de glicose – 1g de mel 49,3800 g de glicose – 100 g de mel 49,3800 g de glicose – 100 g de mel ~49,38 g de glicose em 100 g de mel = 49,38% (m/m) ~49,38 g de glicose em 100 g de mel = 49,38% (m/m) Por conseqüencia, a concentração de carboidratos redutores totais na amostra de mel é de 49,38% (m/m). Por conseqüencia, a concentração de carboidratos redutores totais na amostra de mel é de 49,38% (m/m).

Conclusões Através dos experimentos foi possível concluir que: Através dos experimentos foi possível concluir que: A concentração de carboidratos redutores totais na amostra de mel encontrada foi de 49,38% (m/m); A concentração de carboidratos redutores totais na amostra de mel encontrada foi de 49,38% (m/m); O R² foi considerado relativamente baixo, obtendo uma curva de calibração que não dentro dos parâmetros ideias, porém, dentro do intervalo de confiança estipulado (95%); O R² foi considerado relativamente baixo, obtendo uma curva de calibração que não dentro dos parâmetros ideias, porém, dentro do intervalo de confiança estipulado (95%); Esta concentração de carboidratos redutores foi considerada baixa, em vista do valor que seria esperado (>65%). Esta concentração de carboidratos redutores foi considerada baixa, em vista do valor que seria esperado (>65%). Erros de pipetagem, interferentes ambientais e/ou inerentes à amostra, ou calibração inadequada do fotocolorímetro podem ter causado esse resultado inesperado. Erros de pipetagem, interferentes ambientais e/ou inerentes à amostra, ou calibração inadequada do fotocolorímetro podem ter causado esse resultado inesperado. Entretanto, com um “N” de experimentos confirmatórios, seria possível verificar se a concentração de carboidratos redutores é mesmo esta que está presente na amostra e, se for, esta em desacordo com as normas do INMETRO. Entretanto, com um “N” de experimentos confirmatórios, seria possível verificar se a concentração de carboidratos redutores é mesmo esta que está presente na amostra e, se for, esta em desacordo com as normas do INMETRO.

BOBBIO, P.A., BOBBIO, F. O. Química do processamento de alimentos. São Paulo:Varela, BOBBIO, P.A., BOBBIO, F. O. Química do processamento de alimentos. São Paulo:Varela, BRASIL, Ministério da agricultura. Instrução Normativa nº. 11, de 20 de outubro de BRASIL, Ministério da agricultura. Instrução Normativa nº. 11, de 20 de outubro de Regulamento Técnico para fixação de Identidade e Qualidade do Mel. Disponível em:. Acesso em 15 de novembro de Regulamento Técnico para fixação de Identidade e Qualidade do Mel. Disponível em:. Acesso em 15 de novembro de Claudécia L. da Silva, Alexandre J. de M. Queiroz & Rossana M. F. de Figueirêdo. Caracterização físico-química de méis produzidos no Estado do Piauí para diferentes floradas. Revista Brasileira de Engenharia Agrícola e Ambiental, v.8, n.2/3, p , Claudécia L. da Silva, Alexandre J. de M. Queiroz & Rossana M. F. de Figueirêdo. Caracterização físico-química de méis produzidos no Estado do Piauí para diferentes floradas. Revista Brasileira de Engenharia Agrícola e Ambiental, v.8, n.2/3, p , INMETRO. Disponível em acessado em 19 de novembro de INMETRO. Disponível em acessado em 19 de novembro de Muñoz, O, Copaja, S, Speisky, H., Peña RC & Montenegro G. Contenido de flavonoides y compuestos fenólicos de mieles chilenas e índice antioxidante. Quím. Nova. v. 30(4), p , Muñoz, O, Copaja, S, Speisky, H., Peña RC & Montenegro G. Contenido de flavonoides y compuestos fenólicos de mieles chilenas e índice antioxidante. Quím. Nova. v. 30(4), p , PORTAL DO AGRONEGÓCIO. Disponível em acessado em 19 de novembro de PORTAL DO AGRONEGÓCIO. Disponível em acessado em 19 de novembro de VILLAS_BÔAS, J.K.; MALASPINA,O. Parâmetros Físico-Químicos Propostos para o Controle De Qualidade do Mel de Abelhas Indígenas Sem Ferrão no Brasil. Mensagem Doce, São Paulo, ed., ano, n.82, p.6-16, 20 de julho de VILLAS_BÔAS, J.K.; MALASPINA,O. Parâmetros Físico-Químicos Propostos para o Controle De Qualidade do Mel de Abelhas Indígenas Sem Ferrão no Brasil. Mensagem Doce, São Paulo, ed., ano, n.82, p.6-16, 20 de julho de Referências Bibliográficas

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