Vetores de entrada para clonagem gênica Os plasmídios devem possuir uma região designada origem de replicação (ORI), que é essencial para a sua replicação e que assim assegura a sua transmissão à descendência da célula bacteriana. É crucial que esta região não seja alterada no processo de clonagem. Nos vetores de clonagem deverão ainda estar presentes regiões que codifiquem proteínas de genes marcadores de seleção. Outra região importante dos vetores de clonagem é o local múltiplo de clonagem (Multiple Cloning Site). Ou seja, vários sítios específicos para cada enzima, justapostos. Grande parte dos vetores usados para a clonagem de genes ou de outros fragmentos de DNA, são os plasmídios que ocorrem naturalmente em muitas espécies bacterianas. Esses plasmídios são úteis para a expressão de genes de qualquer organismo pelo fato de serem capazes de replicar, de forma independente do cromossomo. No entanto, para poderem ser usados em clonagem, estes plasmídios naturais precisam apresentar outras características:

Enzimas de restrição Funcionam como "tesouras" capazes de clivar o DNA com precisão em locais bem definidos. Hoje em dia conhecem-se centenas de enzimas de restrição isoladas de numerosas bactérias, estando o nome da enzima relacionado com o organismo de onde esta foi isolada. As enzimas de restrição reconhecem e atuam sobre sequências específicas de DNA, catalisando a destruição de uma ligação fosfodiéster entre dois nucleotídeos consecutivos ligados a determinadas bases. Um corte num fragmento de DNA por uma enzima de restrição gera dois fragmentos, podendo as extremidades resultantes desse corte ser de dois tipos: coesivas ou cegas.

Ligação Após preparação das moléculas de DNA que se pretende recombinar in vitro, segue-se o processo de ligação. Caso o vetor de clonagem e o fragmento de DNA a clonar tenham sido tratados com a mesma enzima de restrição, as suas extremidades (em grande parte dos casos, coesivas) serão compatíveis, possibilitando o emparelhamento entre bases complementares por ligações de hidrogênio. Há ainda que promover a ligação covalente (uma ligação fosfodiéster) entre os dois nucleotídeos das extremidades das duas moléculas a ligar. Para tal, usa-se uma enzima chamada DNA ligase, que catalisa a ligação entre o grupo fosfato ligado ao carbono 5’ e o grupo hidroxila ligado ao carbono 3’ das moléculas de desoxiribose presentes no DNA, numa reação que para se dar necessita de ATP.

Vetor Fragmento de DNA alvo Clivagem do DNA com enzima de restrição para produzir extremidades coesivas Ligação das extremidades coesivas (DNA Ligase) DNA Recombinante Inserto

Transformação de células hospedeiras A etapa seguinte consiste na introdução das moléculas de DNA recombinado (vetor com o DNA exógeno clonado) num hospedeiro adequado que a transmita às gerações celulares seguintes, ou seja que transforme as células hospedeiras. Dentre as colônias transformadas com o vetor recombinado (normalmente mutantes de Escherichia coli) é necessário conseguir selecionar aquelas que contêm, de fato, o DNA de interesse, excluindo assim as colônias que, ou não contêm o vetor, ou contêm o vetor “vazio”. O processo de seleção de células é feito através dos genes marcadores contidos no vetor recombinante.

DNA Recombinante