Profa. Dra. Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki Abelhas sem ferrão no monitoramento de resíduos de pesticidas e qualidade do mel Profa. Dra. Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki

Polinizadores de muitas espécies de plantas cultivadas e matas naturais São responsáveis por até 90% da polinização em áreas naturais O que acontece se esses insetos se contaminam com pesticidas ou outros compostos xenobióticos? O que acontece com a sua cria, o ninho, a colmeia e com os seus produtos que muitas vezes são utilizados por nós?

Relatos de casos de sumiço de abelhas nativas sem ferrão – Paraná Será que os pesticidas, em especial inseticidas podem estar relacionados com esse sumiço? Caixa abandonada de Leurotrigona muelleri Cambé-PR Caixa abandonada de Plebeia droryana Cambé-PR

Esse desaparecimento de abelhas sem ferrão está muito parecido com a Desordem do Colapso das Colônias (CCD) descrita para as abelhas Apis mellifera – primeiro relato em outubro de 2006 na costa leste dos EUA CCD - ausência de abelhas vivas ou morta na colônia, mas com a presença de crias e alimento, podendo ser encontrado, em alguns, uma pequena quantidade de operárias e a rainha dentro da colmeia. Em colmeias em há operárias observa-se uma relutância da colônia em consumir o alimento energético ou proteico fornecido. Prováveis causas da CCD em A. mellifera: uma nova doença que acomete as abelhas – parasita ou patógeno envenenamento por defensivos agrícolas desnutrição alto nível de consanguinidade estresse ambiental manejo apícola inadequado

CCD pode estar afetando as abelhas nativas sem ferrão? Será que as causas são as mesmas que afetam as A. mellifera? Um dos fatores seria a ação de pesticidas como inseticidas e herbicidas

Por que estudar os efeitos de agrotóxicos em jataí? Ocorrência alta Facilidade de criação Facilidade de manutenção Espécies de Tetragonisca e sua distribuição Tetragonisca angustula (Latreille, 1811) – Ocorre do México, América Central e América do Sul Tetragonisca fiebrigi (Schwarz, 1938) – Brasil (Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Paraná, Rio Grande do Sul, São Paulo), Argentina, Bolívia e Paraguai Tetragonisca weyrauchi (Schwarz, 1943) – Bolívia, Perú e Brasil (Acre, Mato Grosso, Rondônia) Tetragonisca buchwaldi (Friese, 1925) – Costa Rica, Panamá e Equador

Tetragonisca weyrauchi – jataí acreana Tetragonisca angustula Tetragonisca fiebrigi

Toxicidade dos inseticidas medida CL50 (concentração letal que proporciona a morte de 50% da população) Quatro classes de agrotóxicos de acordo com a CL50 para abelhas: Classe 1- extremamente tóxicos CL50 > 2μg/abelha • Classe 2- altamente tóxicos CL50 entre 22μg e 10,99μg/abelha • Classe 3- moderadamente tóxicos CL50 entre 11μg e 100μg/abelha • Classe 4- pouco tóxicos CL50 < 100μg/abelha (Larini, 1999; Hunt, 2000)

Abelhas jataí Tetragonisca angustula e Tetragonisca fiebrigi como bioindicadores Trabalho desenvolvido por Ana Lucia Paz Barateiro Stuchi – tese de doutorado – Pós-Graduação em Zootecnia (2005 a 2009) Nesse estudo foram avaliadas as alterações ocorridas na expressão gênica de abelhas do gênero Tetragonisca após contaminação com agrotóxicos para, posteriormente, utilizar esses insetos como bioindicadores de agrotóxicos.

A B EST-2 EST-3 EST-4 EST-1 + Perfil eletroforético das esterases em gel de poliacrilamida. A = extratos de cabeça/tórax de operárias de Tetragonisca fiebrigi e B = extratos de cabeça/tórax de operárias de Tetragonisca angustula. (Sociobiology, v. 59, n. 1, 123-134,2012)

Concentrações letais a 50% (CL50) das abelhas Tetragonisca fiebrigi submetidas ao fipronil, malathion, neem e thiamethoxam, tanto por contato (papel filtro) como por ingestão (alimento) Agroquímico CL50 (%) 95% Limite de confiança Fipronil – contato 0,00062 0,00053 – 0,00075 Fipronil – ingestão 0,00123 0,00121 – 0,00127 Malathion – contato 0,50 ----- Malathion – ingestão 0,38 0,22 – 0,55 Neem - contato Neem - ingestão Thiamethoxam - contato 0,79 0,61 – 1,04 Thiamethoxam – ingestão 0,21 0,17 – 0,27

Inibição da atividade das esterases detectada em T Inibição da atividade das esterases detectada em T. fiebrigi após contato com fipronil, malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (++) aumento de intensidade da banda Concentrações Esterases EST-1 EST-2 EST-4 Fipronil (%) 0,0001 - 0,0005 0,0006 0,0007 0,0011 Malathion (%) 0,0017 0,0018 0,0019 0,002 0,004 Thiamethoxam (%) 0,7 0,8 0,85 0,9 ++ 1

Inibição da atividade das esterases detectada em T Inibição da atividade das esterases detectada em T. fiebrigi após ingestão de fipronil, malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (+) inibição parcial Concentrações Esterases EST-1 EST-2 EST-4 Fipronil (%) 0,0011 - 0,0012 + 0,00125 0,0025 0,025 Malathion (%) 0,2 0,3 0,4 0,45 0,5 Thiamethoxam (%) 0,15 0,22 0,24

Malathion Controle EST-4 + EST-3 Perfil eletroforético das esterases de extratos de cabeça/tórax de T. angustula, mostrando a inibição parcial da EST-3 e EST-4, após contaminação por contato com o inseticida malathion na concentração de 0,003%.

Concentrações letais a 50% (CL50) das abelhas T Concentrações letais a 50% (CL50) das abelhas T. angustula submetidas ao fipronil, malathion, neem e thiamethoxam, tanto por contato (papel filtro) como por ingestão (alimento) Agroquímico CL50 (%) 95% Limite de confiança Fipronil – contato 0,00053 0,00024 – 0,00064 Fipronil – ingestão 0,00056 0,00053 – 0,00059 Malathion – contato 0,00315 ----- Malathion – ingestão 1,33 0,54467 – 2,18486 Neem – contato Neem – ingestão Thiamethoxam - contato 0,1622 0,06343 – 0,34581 Thiamethoxam – ingestão 0,2133 -0,00039 – 0,5357

Inibição da atividade das esterases detectada em Tetragonisca angustula após contato com malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (+) inibição parcial Concentrações Esterases EST-3 EST-4 Malathion (%) 0,0025 - + 0,0028 0,003 0,004 0,1 Thiamethoxam (%) 0,05 0,07 0,2 0,3

Inibição da atividade das esterases detectada em T Inibição da atividade das esterases detectada em T. angustula após ingestão de malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (+) inibição parcial Concentrações Esterases EST-3 EST-4 Malathion (%) 0,4 - 0,6 1 + 2 3 Thiamethoxam (%) 0,005 0,008 0,01 0,02 0,03

Abelhas jataí bioindicadores da presença de resíduos de Herbicidas Trabalho desenvolvido por Fábio Fermino – Dissertação de mestrado – Pós-Graduação em Genética e Melhoramento (2008 a 2010) Herbicida Diluição (%) Concentração (g/ml) Sanson 40 SC Nicossulfuron 40 g/l 100 0,0003 75 0,000225 50 0,00015 10 0,00003 1 0,000003 Gramoxone 200 1,1'−dimetil−4,4'−bipiridilio dicloreto (paraquat) 200g/l 0,0015 0,000015 0,1 0,0000015

Sanson 40 SC® (nicosulfuron) Mortalidade de T. angustula nos bioensaios com os herbicidas nicosulfuron (Sanson 40 SC®) e paraquat (Gramoxone 200®) após 24h de exposição. Teste Concentração (%) Concentração (g/ml) Mortas Vivas % Indivíduos mortos Controle (água destilada) ---- 56 Sanson 40 SC® (nicosulfuron) 1 0,000003 60 10 0,00003 4 57 6,5 50 0,00015 75 0,000225 46 8,0 100 0,0003 Total 8 339 Gramoxone 200® (paraquat) 0.1 0,0000015 40 0,000015 0,0015 36 10,0 216

Inibição da atividade das isoenzimas malato desidrogenase (MDH), superóxido dismutase (SOD) e esterase (EST) detectada em T. angustula após contato com Nicosulfuron e Paraquat. (+) ausência de inibição; (+-) inibição parcial; (-) inibição total; (++) aumento na expressão. Isoenzimas Herbicidas MDH-2 MDH-3 SOD-1 EST-3 EST-4 Nicosulfuron (%) 1% + 10% 50% 75% +- 100% Paraquat (%) 0,1% ++ -

Inibição da atividade das isoenzimas malato desidrogenase (MDH), superóxido dismutase (SOD) e esterase (EST) detectada em T. fiebrigi após contato com Sanson e Paraquat. (+) ausência de inibição; (+-) inibição parcial; (-) inibição total; (++) aumento na expressão. Isoenzimas Herbicidas MDH-2 MDH-3 SOD-1 EST-1 EST-2 EST-4 Nicosulfuron (%) 1% + 10% 50% 75% +- 100% Paraquat (%) 0,1% - ++

ALTERAÇÃO DA EXPRESSÃO DE ESTERASES E PROTEÍNAS TOTAIS DE tetragonisca angustula Latr.VISITANTES DE FLORES DE CAFÉ (Coffea arabica L.) APÓS PULVERIZAÇÃO COM O INSETICIDA neem Trabalho desenvolvido por Mayra Cristina de Araujo – Monografia – especialização em Biotecnologia aplicada a agroindústria - UEM Vista da entrada do ninho de T. angustula utilizado no bioensaio durante a florada de cafezal em Apucarana-PR Vista da florada de cafezal (C. arábica) em Apucarana-PR - 2009

Local: Cafezal do Sítio Penitente em Apucarana – Paraná Início da florada (botões florais começando a abrir) cafeeiros foram pulverizados com o inseticida neem comercial Caixa comerciais de jataí foram instaladas como segue a aproximadamente 100m do pés de café: Tratamento: uma das caixas foi instalada a 100m de uma fileira lateral e 24 horas depois foi realizada a aplicação do inseticida comercial neem de acordo com as instruções constantes da embalagem; Controle: A segunda caixa de jataí foi instalada na extremidade oposta a aproximadamente 600m de distância da caixa anterior e 24 horas depois foi realizada pulverização apenas com água.

No campo foi observado que: Operárias adultas foram coletadas na entrada do ninho tratado e controle após: 24h 48h 72h Análise das esterases: inibição parcial das EST-3 e EST-4 após 48h da contaminação, em comparação com o controle. Análise das proteínas totais: ocorreu um aumento na quantidade de peptídeos após 24h da contaminação No campo foi observado que: os pés de café pulverizados com neem repeliram parte das T. angustula que estavam forrageando e que não houve mortandade de abelhas após a aplicação do inseticida.

Análise da expressão gênica em Tetragonisca angustula L Análise da expressão gênica em Tetragonisca angustula L. após a contaminação com inseticidas Trabalho desenvolvido por Carlos Vinício Prescinato De Oliveira – Dissertação de mestrado – Pós-Graduação em Genética e Melhoramento

Inseticidas reguladores de crescimento Galaxy EC 100 – princípio ativo Novaluron Natuneem – extrato da planta neem (Azadirachta indica )– princípio ativo azadiractina AzaMax – princípio ativo azadiractina Contaminação por contato dentro das colmeias por longo período de tempo Concentrações subletais Bioensaios realizados no setembro de 2010 a outubro de 2011

Gallaxy EC 100 princípio ativo - novaluron (100g/L), é um inseticida regulador de crescimento que atua principalmente na síntese da cutícula do inseto, inibindo a síntese de quitina e, consequentemente, inibindo a muda do inseto. Azadiractina - pode afetar a sobrevivência, causar repelência, deterrente alimentar (impede que outros organismos se alimente da planta), regular o crescimento, reduzir a fertilidade de fêmeas, causar anormalidades anatômicas, provocar efeitos histopatológicos prejudiciais em glândulas produtoras de neurôrmonios, em tecidos reprodutivos e em células epiteliais do intestino, afetar o metabolismo de proteínas em insetos.

Diluições dos inseticidas utilizados nos experimentos Concentrações em % Gallaxy EC 100 0,5 6,25 10 NatuNeem 2,5 100 AzaMax 1 5

Procedimento experimental Inseticidas diluídos em água destilada Aplicou-se 01 mL do inseticida diluído em folha de papel filtro (12,5 ± 0,1 cm) – colocadas para secar. Folhas de Papéis filtros contaminadas foram introduzidas no interior dos colmeias Controle – mesmo procedimento para os ninhos contaminados, porém aplicou-se apenas 01 mL de água destilada

Coletas de operárias para análise das esterases e proteínas totais: 48 horas 120 horas 168 horas 30 dias 60 dias

Esterases Galaxy ED 100 NatuNeem AzaMax EST-4 + 60 dias 0,5% + 48 horas 2,5% - 30 dias 0,5% - 48 horas 1% + 60 dias 1% EST-3 Sem alteração Sem alteração

Inseticidas utilizados Concentrações em % Gallaxy EC 100 6,25 Síntese de novos peptídeos até 168 horas NatuNeem 0,5 Redução da síntese proteica e surgimento de peptídeos após 60 dias 2,5  Surgimento de peptídeo após 48 horas  alterações até 168 horas 100  Novo peptídeo (120 horas) e alterações na síntese até 168 horas AzaMax 1  Aumento da síntese proteica até 168 horas

Eletroforese SDS-PAGE 7% de T Eletroforese SDS-PAGE 7% de T. angustula após a exposição ao inseticida Gallaxy EC 100 6,25% por 120 horas, coloração nitrato de prata. Os asteriscos seguidos de letras são para identificar horizontalmente as regiões de peptídeos afetados. P.M: padrão de peso molecular. 01-09: controle. 11-20: tratados.

Após 48 horas da contaminação com AzaMax a 5% não foi possível coletar abelhas na entrada do ninho - nos períodos de forrageamento, manhã e tarde, a partir de 48 horas após contaminação a quantidade de abelhas na entrada do ninho e forrageando diminuiu drasticamente ao longo dos dias. Nenhuma abelha morta foi encontrada no entorno do ninho. seria a ação repelente do AzaMax?

Pesticidas em concentrações subletais alteram a expressão de esterases e de proteínas solúveis em abelhas T. angustula e T. fiebrigi Essas alterações refletem o metabolismo intermediário dessas abelhas – detoxificação O aumento de síntese de proteínas pode estar levando essas abelhas a apresentarem uma resposta ao estresse ambiental (presença do pesticida) que pode ser: Nova proteína sintetizada Comportamental, por exemplo: alteração na orientação, abandono do ninho

Questões a serem respondidas A rainha é afetada pelos pesticidas? E a cria? Há contaminação do mel e pólen? Com quais pesticidas ocorre alteração comportamental ? Quais alterações? Quais as concentrações míneemas que afetam as abelhas e seus produtos?

Qualidade do Mel É importante destacar que a composição exata de qualquer mel depende, principalmente, das fontes vegetais das quais ele é derivado, mas também do clima, solo e outros fatores Várias metodologias utilizadas para a determinação de resíduos de agrotóxicos são baseadas em métodos cromatográficos Resíduos de contaminantes também podem ser identificados em amostras de pólen - cromatografia líquida com espectrometria de massa A presença de resíduos de pesticidas pode ser identificada ainda com o corpo das abelhas – mas não há técnica eficiente. Uma técnica utilizada é a cromatografia gasosa

Alguns cuidados que podem diminuir a contaminação com agrotóxicos Se houver cultivo nas proximidades verificar se há uma grande faixa de vegetação nativa – início da faixa – 1,5 Km da lavoura Os limites estabelecidos de acordo com o RT (tempo residual) de cada substância devem ser respeitados, e evitar a aplicação de inseticidas que tenham RT acima de 8h.

Não se deve fazer pulverizações quando a temperatura estiver muito baixa – porque isso aumenta o RT Não se aplicar pesticidas durante o pleno florescimento da cultura ou de plantas presente nas proximidades   Usar as formulações menos perigosas quando for possível – formulações granuladas e em solução. Evitar o uso de microcápsulas – liberam o ingrediente ativo gradativamente As instruções estabelecidas pelos fabricantes devem ser obedecidas, respeitando a quantidade e a forma de aplicação.

Obrigada!