Sistema Rh Lilian Castilho, PhD Simpósio Hemopasso Passo Fundo, 24 a 26/03/2008

Sistema Rh Sistema complexo Principais antígenos D; C/c; E/e muitos fenótipos no mínimo 200 alelos um fenótipo pode gerar vários genótipos Principais antígenos D; C/c; E/e 8 haplótipos: Dce(R1),Ce(r’), DcE(R2), cE(r”), Dce(R0), ce(r), DCE(RZ), CE(ry)

Sistema Rh:Terminologia Rh não Rhesus Sistema ISBT: 004 Símbolo ISBT: RH Fenótipo: D+C+E-c+e+ RH:1,2-3,4,5 Dce/ce ou Dce/dce=R1r Provável genótipo: DCE/ce, RH*1,2,5/RH*4,5 ou R1r

Questões frequentemente realizadas Por que RhD é tão imunogênico? Principal causa da DHFR 40-75% dos D- tornam-se aloimunizados quando expostos a hemácias D+ Por que o sistema Rh é tão complexo? - Número elevado de antígenos D, C/c, E/e (comuns) ~outros 40 Variantes - Diferenças na expressão de D D positivo ou D negativo? - D fraco - D parcial Por que grupos étnicos Africanos/ Hispânicos desenvolvem anticorpos RhD complicados? Anti-D em D+, D fraco

Locus RH Duplicação de 2 Genes ce “Rh negativo” Deletado X Europeus- 15-17% X “Rh positivo” RHD RHCE ce, Ce, cE, or CE antígeno D antígenos CcEe RhCE RhD C/c E/e The Rh locus on chromosome 1 consists of 2 genes: one encodes D and the other encodes the various forms of the CE. The fact that the C and E antigens are carried on the same protein explains the compound antigens-like little f (ce) or rhi (big C little e) and Rh27 (c-Big E). The two genes arose following a duplication event, but have since diverged or changed so that they now encode proteins that differ by 32 or 35 amino acids, depending on whether you are comparing D to Ce or ce. The genes are close together (“tightly linked” )- are in reverse orientation (3’ ends close together with a small gene (SMP1) of unknown function separating them. This arrangement is thought to allow “hairpin” formation and exchange between them. Circulos- representam 32-35 diferentes amino acidos entre RhD e RhCE 1. Esta diferença explica por que RhD é tão imunogênico Maioria dos antígenos de grupos sanguíneos diferem em um (ou poucos) aa

2. Por que o sistema Rh é tão complexo ? antígeno D antígenos CcEe RHD 5’ 3’ RHCE ce, Ce, cE, or CE - Localização no cromossomo- genes muito próximos Orientação – final 3’ face a face um com outro RHD 5’ RHCE 3’ 3 Durante a replicação cromossômica formação de hair-pins trocas ocorrem - um atua como template para a porção do outro “Conversão gênica” Principal causa para a diversidade RH The Rh locus on chromosome 1 consists of 2 genes: one encodes D and the other encodes the various forms of the CE. The fact that the C and E antigens are carried on the same protein explains the compound antigens-like little f (ce) or rhi (big C little e) and Rh27 (c-Big E). The two genes arose following a duplication event, but have since diverged or changed so that they now encode proteins that differ by 32 or 35 amino acids, depending on whether you are comparing D to Ce or ce. The genes are close together (“tightly linked” )- are in reverse orientation (3’ ends close together with a small gene (SMP1) of unknown function separating them. This arrangement is thought to allow “hairpin” formation and exchange between them. 5’

Diferenças na expressão de RhD D-negativo - 15-17% Europeus- devido a deleção RHD 3-7% Africanos, 0.5-1% Asiáticos – devido a mutações RHD D-positivo – Maioria tem o gene RHD – MAS HÁ EXCEÇÕES D Fraco – requer teste indireto da antiglobulina para detecção trocas de único amino ácido (transmembrana) diminuição na QUANTIDADE DE RhD 53 “tipos de D fracos” diferentes Del - expressão muito fraca de D- não detectável por sorologia adsorve e elui anti-D mais comum em populações Asiáticas D Parcial –epítopos de D alterados tipam como D+ mas desenvolvem anti-D Causas – Troca de único amino ácido na superfície da hemácia - Parte do gene RHD substituído pelo RHCE

Problemas devido a D Fraco e Del RhD Fraco V270G Tipo 1 Alguns são difíceis de detectar com reagentes sorológicos Discrepâncias na tipagem: D- com um reagente; D+ com outro Se unidades de sangue de doador são rotuladas como D- podem estimular anti-D em receptores D- Exemplos: D Fraco tipo 2 D Fraco com RHCe em trans Del- nenhum reagente detecta 2. Alguns pacientes desenvolvem anti-D Preconizado- maioria dos pacientes com D fraco não desenvovem anti-D - altera quantidade da proteína, mas não os epítopos D da supefície - Não é regra para todos os tipos de D fracos – difícil de pré determinar

Proteína D Fraco RhD: 10.000 a 25.000 sítios/hemácias D Fraco: densidade antigênica varia de acordo com o tipo de D fraco: 66 a 5.000 sítios/hemácia 2500 tipo 4 1500 tipo 3 1000 tipo 1 500 tipo 2 Cut off sorológico= 500 ags/hemácias tipo 5 300 D fraco tipo 5: geralmente tipados como RhD-negativo

Proteína Del Cut off sorológico=500 ags/hemácias RhD: 10.000 a 25.000 sítios/hemácias Del: densidade antigênica: < 50 sítios/hemácia Cut off sorológico=500 ags/hemácias Del: geralmente tipados como RhD-negativo DEL encontrado nos raros Asiáticos RhD-negativos e são C+ ou E+

Problemas com D Parcial Hemácias D Parcial tipam como D+ e não são identificadas até que o paciente desenvolva anti-D possuem epítopos de D alterados NH2 DMH- L54P DFW- H166P DHMi- T283I DII- A354D DVII- L110P DHR- R229K DNU-G353R DNB- G355S - Devido a mutações localizadas na região extracelular Devido a proteínas RhD/RhCE híbridas DIII DIV DV DVI DBT DAR DOL DAU etc.

Proteína D Parcial RhD: 10.000 a 25.000 sítios/hemácias D parcial: densidade antigênica: 500 a 25.000 sítios/hemácia D Cat VI e DAR: podem ser tipados como RhD-negativo

Tipagem RhD: positivo ou negativo? Pacientes Anti-D#1 (IgM) Anti-D#2 Resultado Transfusão POS RhD+ NEG RhD- DF/DP? RhD-* DF?DP? * até resolver a discrepância: painel de monoclonais ou genotipagem

Tipagem RhD: positivo ou negativo? Doadores Anti-D#1 (IgG/AGH) Resultado Transfundir para pacientes POS RhD+ NEG RhD- RhD-* POS Fraco DF/DP? RhD-** Voce sabe qual é sua unidade RhD-negativo? * genotipagem? ** até resolver a discrepância: genotipagem

D Fraco ou D parcial?

D Fraco ou D parcial? Identificação em gel Painel com 12 soros monoclonais (DII, DNU, DIII, DIV, DV, DVI, DVII, DFR, DBT, DHAR, DAR, DCS, DOL, DHK/DAU-4, Weak D 5,7, Weak D type 38)

D Fraco ou D neg?

D Fraco

D-neg, D fraco ou Del ? – D conf.

D-neg, D fraco ou Del ? – D Fraco tipo 38

D-neg, D Fraco ou Del ? DEL RHD(M295I)

D Fraco IgG IgM PAP DF1 DF4 DVI

Problemas nos testes sorológicos Testes sorológicos não distinguem D fraco de D parcial com fraca expressão Testes sorológicos não detectam alguns D fracos, Del e D parcial

Imunizam receptores D-negativos Testes sorológicos associados a testes moleculares auxiliam na identificação de variantes do antígeno D D Fraco e D parcial Imunizam receptores D-negativos Desenvolvem anti-D

Casos enviados ao nosso laboratório para genotipagem RHD (2007) Tubo Gel Variações de D IgM Poli DVI+ DVI- Dconf. DF1 0/(+) 0/1+ 0/2+ 1+/3+ DF2 2+/3+ DF3 2+ 4+ DF4 (+)/3+ DVI 1+/4+ DF1+DF2 0/3+ 02+ (+)/2+ 3+ DF1+DF4 (+)/4+ DF1+DF2+DF3  

Reagentes anti-D na detecção de D fraco e D parcial Amostras Tipos de D fraco e D parcial Graus de aglutinação Densidades antigênicas Anti- D mono (gel) Anti-D conf (gel) 9 DF1 2+ 3+ 1273 4 DF2 1+ 462 1 DF3 1936 13 DF4 4+ 2184 2 DAR 988 DHMi 1112 3 DVI (+) 1050 DF1/DHMi 1577 DF4/DAR 1432

Genotipagem RHD em doadores de sangue Indicações: Discriminar D neg de DEL e D pos Discriminar D parcial e D Fraco Limitações Custo Tempo Imunogenicidade de DEL? Quem deveria ser testado? Doadores de primeira vez Doadores de repetição (discrepâncias) Esta unidade é RH compatível?

Aplicações clínicas Genotipagem RH Pacientes com fenótipos D fraco D fracos mais frequentes devem ser transfundidos com hemácias RhD pos (3 a 6% das unidades RhD-neg são preservadas) Doadores de sangue Triagem para DEL e D fraco entre doadores sorológicamente D neg (prevenção da aloimunização)

Recomendações clínicas para pacientes com o fenótipo D fraco Transfusão D fraco tipo 1 RhD-positivo D fraco tipo 2 RhD-positivo D fraco tipo 3 RhD-positivo D fraco tipo 4.0 RhD-positivo D fraco tipo 4.1 RhD-positivo D fraco tipo 4.2 RhD-negativo D fraco tipo 5 RhD-negativo D fraco tipo 11 RhD-negativo D fraco tipo 15 RhD-negativo Outros tipos RhD-negativo

Caso Clínico Paciente Afro brasileira, sexo feminino, 36 anos com sangramento vaginal Solicitado 2 unidades de sangue 2 gestações Tipada como O RhD+ Anti-D fraco detectado no soro Sem história de profilaxia Rh (óbvio!)

Soro testado com painel de 6 monoclonais para detectar D parcial Caso Clínico Soro testado com painel de 6 monoclonais para detectar D parcial Anti-D DIII DIV DV DVI DVII DAR DFR Paciente 1 + +/- - 3+ 2 3 4 5 6

Caso Clínico Suspeitas: D Normal – mas por que o anticorpo? DIII? DVII? Outro D parcial? Análise Molecular – screening rotina mostou RHD normal Nenhum gene híbrido presente

Análise do DNA PCR-SSP para DVII: negativo PCR-RFLP para DIIIa: positivo DIIIa! Paciente possuía o fenótipo D parcial Anti-D era um aloanticorpo Paciente ficou muito brava porque seu tipo de sangue estava errado!

Caso Clínico Paciente Caucasóide, sexo masculino, suspeita de AHAI PAI positiva, Auto e TDA positivos Anti-D detectado no soro e eluato Paciente tipado como D+ Anti-D: auto ou alo? Genotipagem!!!!

Caso Clínico Análise molecular de rotina demonstrou um gene RHD normal Nenhum gene híbrido presente, não era DIII e nem DVII Sequenciamento do gene RHD: normal Conclusão: auto-anti-D

Caso Clínico Doador com 9 doações prévias Fenotipado como O RhD-neg em todas as doações Na 100 doação: Suspeita de D Fraco ou Del? Genotipagem!!!!

Caso Clínico Análise molecular demonstrou um gene RHD deletado Nenhum D fraco, DEL e D parcial detectado Conclusão: Doador RhD-negativo

Problemas para resolver variantes RHD Muitas regiões do gene devem ser analisadas Geralmente requer sequenciamento do gene inteiro Necessidade de genotipagem por microarray Conhecimento das mudanças no gene que alteram os epítopos da proteína = clinicamente significantes

Variantes RHCE Problemas na fenotipagem do antígeno C Em Africanos, Hispânicos, e grupos étnicos mistos com um gene híbrido D-CE-D específico RHD RHCE ces W16C L245V 15 % D/Ce/D híbrido: D-negativo C-positivo Variante ce Fenótipo C positivo; desenvolve anti-C Gene híbrido D-CE-D associado a variante e; desenvolve anti-e Este haplótipo RH é frequente em pacientes falciformes aproximadamente 22% Africanos

Variantes RHCE Problemas na fenotipagem do antígeno e Em Africanos, Hispânicos, e grupos étnicos mistos ce “convencional” Muitos genes diferentes, todos com expressão alterada do antígeno e ces W16C L245V G336C ceMO W16C V223F ceEK M238V R263G M267K W16C ceAR M238V L245V R263G M267K I306V W16C ceBI W16C M238V A273V L378V Fenótipo e-positivo Desenvolvem anti-e e/ou anti-ce Frequentes em pacientes falciformes

Antígenos do Sistema Rh Anticorpos do Sistema Rh Antígenos Rh (D, C/c, E/e) são resistentes ao tratamento por enzimas, DTT, cloroquina Anticorpos do Sistema Rh Alo-anticorpos anti-D, -E, -c, -C, -e IgM ou IgG reativos a 37oC, AGH, enzimas clinicamente significantes Auto-anticorpos frequentes (anti-e)

Anticorpos do Sistema Rh Alo-anticorpos anti-C associado a anti-G Anti-C associado a anti-e anti-E associado a anti-c anti-e detectado em hemácias e-positivas

Tipagem RhD: positivo ou negativo? Perspectivas Genótipo Fenótipo aglutinação DNA +

Obrigado pela atenção!