UBA III – Biologia Molecular Aula Laboratorial 1 2013/2014 Maria José Correia mariacorrei@gmail.com

UBA-III Biologia Molecular 2013/2014 Sumário L1 Apresentação sucinta do programa das aulas laboratoriais; Segurança no laboratório Introdução às técnicas básicas para o estudo dos ácidos nucleicos Isolamento e purificação de DNA UBA-III Biologia Molecular 2013/2014

UBA-III Biologia Molecular 2013/2014 Programa Aula Data Tema 1 10/10 Introdução às técnicas básicas para o estudo dos ácidos nucleicos. 2 17/10 Separação dos fragmentos de DNA em gel de agarose e análise dos resultados. Ficha de avaliação UBA-III Biologia Molecular 2013/2014

UBA-III Biologia Molecular 2013/2014 Segurança no laboratório Regras gerais: Nunca COMER, BEBER, FUMAR, aplicar lentes de contato ou cosméticos! Nunca cheirar soluções ou reagentes Nunca pipetar com a boca Lavar as mãos antes de iniciar o trabalho UBA-III Biologia Molecular 2013/2014

UBA-III Biologia Molecular 2013/2014 Segurança no laboratório Atitudes: Usar o senso comum (a maioria dos acidentes de laboratório começa com algo simples); Estar consciente – conhecer os reagentes antes de os usar (ler os rótulos, etc.) Estar protegido – conhecer as práticas e equipamentos que podem aumentar a proteção (máscaras, luvas, etc.) UBA-III Biologia Molecular 2013/2014

UBA-III Biologia Molecular 2013/2014 Segurança no laboratório Bancada: As bancadas de trabalho devem ser mantidas organizadas e limpas Identificar todo o material utilizando para isso marcadores de vidro apropriados Os lixos devem ser perfeitamente identificados O material de vidro estalado ou partido deve ser imediatamente rejeitado UBA-III Biologia Molecular 2013/2014

UBA-III Biologia Molecular 2013/2014 Segurança no laboratório Protecção pessoal: Usar bata e manter os cabelos compridos apanhados; Usar a hotte sempre que necessário; Antes de abandonar o laboratório , limpar a bancada, retirar a bata e lavar as mãos. UBA-III Biologia Molecular 2013/2014

UBA-III Biologia Molecular 2013/2014 Instruções gerais Ler os protocolos antes de cada aula prática Seguir atentamente as instruções fornecidas pelo docente antes de executar o trabalho proposto Depois de terminar o trabalho de cada aula arrumar a bancada. UBA-III Biologia Molecular 2013/2014

UBA-III Biologia Molecular 2013/2014 Introdução às técnicas para estudar os ácidos nucleicos Manipulação de moléculas de DNA Isolamento e purificação de DNA genómico Separação em gel de agarose Aplicações biotecnológicas UBA-III Biologia Molecular 2013/2014

UBA-III Biologia Molecular 2013/2014 Técnicas de extração de DNA genómico DNA lise celular libertação de todo o material intracelular precipitação de proteínas e detritos celulares purificação do DNA UBA-III Biologia Molecular 2013/2014

UBA-III Biologia Molecular 2013/2014 Lise celular Lise mecânica/física Homogenizador Ultra-sonicador French pressure cell press Fervura e pressão osmótica Lise alcalina soluções fortemente alcalinas (de hidróxido de sódio) SDS (dodecil sulfato de sódio) Lise enzimática Proteases Rnases Existem vários métodos de extracção de DNA plasmídico. O método utilizado neste trabalho consiste numa modificação do método de lise alcalina (Birnboim & Doly, 1979). O processo, que permite a extracção de DNA plamídico de células de bactéria, consiste em provocar a lise destas numa solução fortemente alcalina (de hidróxido de sódio) contendo SDS (dodecil sulfato de sódio). Esta solução causa simultaneamente a dissolução da membrana plasmática, a desnaturação de macromoléculas (proteínas e DNA) e a hidrólise do RNA. As macromoleculas são depois precipitadas por adição de acetato de potássio (KAc), e devido ao pH ácido desta solução o pH do lisado é neutralisado. O reequilíbrio do pH permite a renaturação do DNA plasmídico, restabelecendo a sua conformação original. O DNA genómico, devido às suas dimensões e estrutura, não consegue voltar à sua forma nativa, permanecendo sob a forma de agregados complexos. Após a adição do KAc é pois possivel, por centrifugação, separar um sedimento, constituído por membranas, proteínas e DNA cromossómico, de um sobrenadante onde o DNA plamídico se encontra dissolvido. Uma desproteinização mais profunda desse sobrenadante pode posteriormente ser levada a cabo utilizando-se uma mistura de fenol-clorofórmio (1:1), de modo a obter DNA plasmídico suficientemente puro e assim adequado a servir de substrato para os enzimas de restrição. No final, o DNA plasmídico purificado é precipitado com etanol, seco sob vácuo, e ressuspenso em tampão TE. UBA-III Biologia Molecular 2013/2014 11

UBA-III Biologia Molecular 2013/2014 Precipitação diferencial Fenol/Clorofórmio/Álcool isoamílico Fenol e clorofórmio desnaturam as proteínas Fase fenólica (proteínas em solução) separa-se da fase aquosa (DNA) Precipitação com etanol absoluto (ou isopropanol) Insolubilidade do DNA em etanol Presença de catiões monovalentes UBA-III Biologia Molecular 2013/2014

Extração de ácidos nucleicos amostras diversas lise celular Precipitação de proteínas Precipitação de DNA Ressuspensão do DNA em TE (pH8.0) ou em água estéril UBA-III Biologia Molecular 2013/2014