Imunohistoquímica

A imuno-histoquímica (IHQ) combina Anatomia Patológica, Imunologia e Bioquímica. Baseia-se na conjugação de distintos marcadores, com moléculas de imunoglobulina, que com auxílio de um substrato específico localiza o antígeno tecidual. Atualmente há disponibilidade de grande número de anticorpos para uso em tecidos fixados em formol e incluídos em blocos parafina, permitindo o estudo de blocos arquivados por longos períodos.

A técnica de IHQ mais usada é a indireta, associada ao complexo avidina-biotina-enzima.  O complexo é formado pela ligação de uma molécula de strepto-avidina com várias de biotina associadas a uma enzima (peroxidase ou fosfatase alcalina), que tem como função a conversão de um cromógeno incolor em um produto final que pode conferir diversas cores aos antígenos teciduais marcados. As cores mais comuns são a castanha (peroxidase+ diaminobenzidina-DAB) e a vermelha (fosfatase alcalina + fast red).

O mecanismo básico da imuno-histoquímica é o reconhecimento do antígeno a ser pesquisado por um anticorpo específico, associado a diversos tipos de processos de visualização.  Cada anticorpo reconhece apenas um único antígeno, que pode ser, por exemplo, uma proteína de uma célula normal, ou neoplásica ou de um microrganismo. A técnica usual utiliza um anticorpo secundário, que se liga ao anticorpo primário e é associado a um complexo de visualização (complexo avidina-biotina-enzima-cromógeno ou polímero com amplificação).

O cromógeno mais utilizado é o DAB (diaminobenzidina) que confere cor marrom ao precipitado permanente - logo, as áreas "reagentes" coram-se de marrom e as "não reagentes, com o corante utilizado para contra-coloração, geralmente a hematoxilina (azul). Atualmente há disponibilidade de grande número de anticorpos primários para uso em tecidos fixados em formol e incluídos em blocos parafina, permitindo o exame imuno-histoquímico de biópsias, peças cirúrgicas e de necropsias arquivados por muitos anos (até mais de um século!). Preparados citopatológicos também podem ser utilizados nos exames imuno-citoquímicos.

Em diversos casos é necessário utilizar o exame imuno-histoquímico, procedimento sensível de detecção molecular que pode auxiliar no diagnóstico de doenças inflamatórias, infecciosas e neoplasias, ou ainda fornecer dados mais precisos e individualizados sobre o melhor tratamento e provável evolução do câncer. A imuno-histoquímica pode auxiliar em diversas situações, tais como:

Diagnóstico de tumores indiferenciados - algumas vezes o exame histopatológico não consegue definir se um tumor é um carcinoma ou linfoma ou melanoma ou sarcoma. Como cada tipo de tumor tem um tratamento e evolução diferente, é importante tentar diferenciá-los através da imunohistoquímica, que vai pesquisar moléculas associadas a diferentes tipos de tumor. Diagnóstico diferencial entre tumores e estados reacionais - alguns processos inflamatórios (reacionais) podem ser de difícil distinção com o câncer pelo exame histopatológico. Por exemplo: linfadenites x linfoma; alterações prostáticas benignas x câncer de próstata; doenças benignas X câncer de mama.

Diagnóstico de diversas doenças infecciosas - por vezes é difícil determinar o agente etiológico de doenças infecciosas, particularmente os vírus. A imuno-histoquímica pode identificar as moléculas produzidas por diversos agentes infeciosos, como o da toxoplasmose e muitos vírus, como o Citomegalovírus (CMV), vírus de Epstein-Barr (EBV), Herpes simples tipos I e II, vírus das Hepatites B e C, HSV8 etc. Determinação de tipo / subtipo de linfomas e leucemias - a adequada classificação destas neoplasias permite o tratamento personalizado e mais eficaz, bem como conhecimento do prognóstico.

Determinação de fatores prognósticos de neoplasias - alguns marcadores imuno-histoquímicos podem ser utilizados para identificar o provável comportamento de uma determinada neoplasia, como a oncoproteína p53 e o antígeno Ki-67 em carcinomas, linfomas e tumores cerebrais etc. Determinação / sugestão de sítio primário de adenocarcinoma – alguns pacientes descobrem um adenocarcinoma sem sítio primário identificado clinicamente. A imuno-histoquímica pode sugerir o sítio primário mais provável e auxiliar na escolha do tratamento mais adequado, bem como conhecimento do prognóstico.

Determinação de fatores preditivos de neoplasias - alguns marcadores imuno-histoquímicos podem ser utilizados para identificar móleculas-alvo para tratamentos modernos e individualizados, beneficiando os pacientes, como os receptores de estrogênio e progesterona e oncoproteína c-erbB2/Her-2-neu no câncer de mama, o CD20 nos linfomas, o EGFR e VEGFR em diversos tipos de tumores etc...

Exemplo de painel de anticorpos para auxiliar na definição da histogênese tumoral:   GFAP CITO- QUERATINA VIMENTINA DESMINA NEURO-FILAMENTOS LCA S100 HMB 45 Carcinoma - + - / + Linfoma + / - Melanoma Rabdomiossarcoma Leiomiossarcoma Sarcoma de Ewing Tumores neurais Tumores gliais

TÉCNICA DE IMUNOHISTOQUÍMICA EM ANATOMIA PATOLÓGICA Os marcadores tumorais realizados são solicitados pelo médico patologista, este seleciona a lâmina do tumor da qual ele julga necessário realizar imunohistoquímica. São realizados novos cortes do bloco de parafina correspondente à lâmina solicitada (preferencialmente de 2 a 3 micras) As lâminas usadas em I.H. são silanizadas (o silano é uma substância química destinada a formação de uma camada compatível entre o corte e a lâmina e facilita a fixação do esfregaço). Cada lâmina corresponde apenas a um marcador tumoral.

Início da Rotina As lâminas devem ser colocadas no carrinho na ordem correspondente ao mapa de trabalho, em seguida devem ser colocadas na estufa a 60°C por até 12 horas. Passado o tempo as lâminas são retiradas da estufa e mergulhadas no xilol e álcool absoluto na seguinte ordem: xilol(1) xilol(2) xilol(3) álcool(1) álcool(2) álcool(3) álcool(4) 5min 5min 5min 10 merg 10 merg. 10merg. 10 merg. Obs: todos as cubas de xilol devem ter a mesma concentração, as de álcool podem ter a mesma concentração ou hidratações progressivas (70%, 50%, 30%)

Em seguida as lâminas são bem lavadas em água corrente, com cuidado para água não “cair” no esfregaço, e depois mergulhadas várias vezes em cuba com água destilada. O processo seguinte consiste em colocar as lâminas em solução de citrato, esta solução é levada para o fogo até atingir a temperatura de mais ou menos 120° C (pode-se colocar em panela de pressão e quando atingir a pressão contar 4 minutos, desligar a panela e deixar esfriar em banho de água corrente). O citrato em alta temperatura tem a finalidade de “quebrar” as ligações de formol contidas no material.

Depois as lâminas são lavadas em água corrente e também em água destilada. Em seguida mergulhar os carrinhos em solução de água oxigenada destilada 10 volumes. A água oxigenada tem a finalidade de bloquear a peroxidase endógena do tecido e isso minimiza a coloração de fundo ou reações inespecíficas, facilitando a interpretação do resultado. Logo após, dar vários banhos de água corrente e depois lavar em água destilada e em seguida mergulhar as lâminas em PBS (solução tampão).

Preparação dos Anticorpos Identificar os tubos de ensaio com o número do paciente e o nome do anticorpo correspondente. Adicionar aos tubos solução de PBS + anticorpo (que deve ser diluido conforme descrição do fabricante) e pingar na lâmina correspondente. Deixar incubando em geladeira “over night”. No dia seguinte tirar da geladeira e mergulhar três vezes em PBS (PH 7,4) pingar anticorpo secundário, mergulhar novamente três vezes PBS, pingar a Estreptoavidina Peroxidase e fazer revelação com o DAB.

Depois de terminado o processo, deve-se contra corar as lâminas para melhorar a visualização (Hematoxilina de Gill por 3 min). Desidratar novamente as lâminas com Álcool Absoluto (2x 5 min cada) e Clarear com Xilol (2x por 5 min). Montar em bálsamo do Canadá.

Lâmina de Imunohistoquímica