Microbiologia Aula prática 1 2013/2014 Maria José Correia mariacorrei@gmail.com 16-09-2013

Sumário P1: Apresentação sucinta do programa das aulas laboratoriais; Segurança no Laboratório Noções de desinfeção, assepsia e esterilização Introdução à microscopia 31/03/2017 Microbiologia 2013/2014

Programa: Data Tema 16/09 O laboratório de Microbiologia (Equipamentos Materiais e Cuidados) 23/09 Meios de cultura e cultivo de microrganismos (Preparação dos meios para a aula seguinte) 30/09 Recolha e processamento de amostras (Recolha pelos alunos de uma amostra do biofilme oral e sua inoculação nos meios apropriados). 7/10 Observação direta de microrganismos (Coloração de Gram das amostras do biofilme oral. 14 e 21/10 Identificação de microrganismos por cultura e testes bioquímicos miniaturizados para identificação de streptococci. Inclui realização de um antibiograma com o microrganismo identificado. 30/10 Ficha de avaliação. Apresentação dos trabalho. 31/03/2017 Microbiologia 2013/2014

Segurança no laboratório: Atitudes: Usar o senso comum (a maioria dos acidentes de laboratório começa com algo simples); Estar consciente – conhecer os reagentes antes de os usar (ler os rótulos tomar as medidas necessárias); Estar protegido – conhecer as práticas e equipamentos que podem aumentar a proteção (máscaras, luvas, etc.). 31/03/2017 Microbiologia 2013/2014

Segurança no laboratório: Regras gerais: Nunca COMER, BEBER, FUMAR, aplicar lentes de contacto ou cosméticos! Nunca cheirar soluções ou reagentes Nunca pipetar com a boca Lavar imediatamente a pele após contacto com culturas/químicos 31/03/2017 Microbiologia 2013/2014

Segurança no laboratório: É especialmente perigoso correr ou brincar em ambientes laboratoriais 31/03/2017 Microbiologia 2013/2014

Segurança no laboratório: Bancada: As bancadas de trabalho devem ser mantidas organizadas e limpas Identificar todo o material utilizando para isso marcadores de vidro apropriados Manter os bicos de Bunsen e as lamparinas acesas apenas enquanto são necessários Os lixos devem ser perfeitamente identificados O material de vidro estalado ou partido deve ser imediatamente rejeitado Colocar as pipetas de vidro sujas em contentores de plástico devidamente identificados para esse fim 31/03/2017 Microbiologia 2013/2014

Segurança no laboratório: Proteção pessoal: Usar bata e manter os cabelos compridos apanhados; Não usar sapatos abertos, chinelos, sandálias; Usar a hotte sempre que necessário; Quando abandonar o laboratório retirar a bata e lavar todas as zonas de pele que possam ter estado expostas a substâncias tóxicas/patogénicas. 31/03/2017 Microbiologia 2013/2014

Instruções gerais: Ler os protocolos antes de cada aula prática Desinfetar as mãos e a bancada No início da aula examinar/registar os resultados das experiências realizadas na aula anterior Seguir atentamente as instruções fornecidas pelo docente antes de executar o trabalho proposto Depois de terminar o trabalho de cada aula arrumar a bancada onde trabalhou. Colocar o lixo e o material inoculado nos locais apropriados Desinfetar a bancada (álcool) e lavar as mãos com sabonete antes de deixar o laboratório 31/03/2017 Microbiologia 2013/2014

Assepsia ausência de microrganismos Manutenção das condições de assepsia: limpar e desinfetar a bancada de trabalho lavar e desinfetar as mãos no início e fim da aula usar bata limpa (sempre) esterilizar o material a utilizar trabalhar à chama ou na câmara de fluxo laminar 31/03/2017 Microbiologia 2013/2014

Técnicas de esterilização Principais agentes anti-microbianos Métodos físicos Calor Radiações Filtros Métodos químicos desinfetante antisséticos 31/03/2017 Microbiologia 2013/2014

Esterilização pelo calor Calor seco Oxidação e desnaturação das proteínas Combustão da matéria orgânica Aplicações: Materiais resistentes a altas temperaturas (ansas, vidros não calibrados, etc.) Equipamento Estufas a 160-180ºC (2 horas) Equipamento de incineração ou queima direta 31/03/2017 Microbiologia 2013/2014

Esterilização pelo calor Calor húmido Coagulação das proteínas; destruição de células vegetativas e esporos Aplicações: Meios de cultura e soluções aquosas Materiais pouco resistentes ao calor (plásticos resistentes, etc.) Equipamento/técnicas: Autoclave (atmosfera de vapor de água sob pressão) Pasteurização (aquecimento do produto por um período de tempo que varia com produto a pasteurizar e a temperatura utilizada) Tindalização (aquecimento a 65-100ºC durante 30-60 min, intercalado com incubação a 35ºC – ciclos que podem repetir-se até 3 dias) 31/03/2017 Microbiologia 2013/2014

Esterilização por filtração Prescott, Microbiology, 5th edition Remoção de microrganismos em membranas filtrantes com poro nominal inferior às dimensões bacterianas (0,2 µm) Aplicações: Produtos termo lábeis, voláteis ou sensíveis a altas pressões (ex: antibióticos e vitaminas) Equipamento/técnicas: Filtração com funil (grandes volumes) Filtração com seringa (pequenos volumes) Filtração de ar em câmaras de fluxo laminar 31/03/2017 Microbiologia 2013/2014

Esterilização por radiações Raios X e : Poder ionizante e elevado poder de penetração - para objectos volumosos Raios UV: Menor energia, radiação pouco penetrante usada para esterilização de superfícies Ultra-sons (radiação de alta frequência) Destruição mecânica de células Raios catódicos (feixes de electrões de intensidade e velocidade elevadas): Esterilização de material cirúrgico 31/03/2017 Microbiologia 2013/2014

Esterilização por agentes químicos Agentes bactericidas ou bacteriostáticos (só eliminam as formas vegetativas e não as formas esporuladas) Sabões, sais biliares e fenóis (alteração da tensão superficial) Cloro (oxidação de compostos celulares) Álcoois (desnaturação de proteínas e solubilização de lípidos) Detergentes germicidas: misturas comerciais de vários agentes bactericidas e bacteriostáticos 31/03/2017 Microbiologia 2013/2014

Introdução à microscopia Prescott, Microbiology, 5th edition Microscópio ótico instrumento usado para ampliar constituído por uma parte mecânica e uma parte ótica Ocular Tubo Revólver Objetiva Platina Diafragma Condensador Fonte de luz Pé Parafuso Macrométrico Parafuso Micrométrico Coluna 31/03/2017 Microbiologia 2013/2014

Microscópio ótico - Parte mecânica Pé ou Base – suporta/estabiliza o microscópio Braço ou Coluna – peça fixa à base, serve de suporte a outros constituintes do microscópio. Tubo ou Canhão –suporta os sistemas de lentes da extremidade superior Platina – peça paralela à base, onde é colocada a preparação a observar, possuindo no centro um orifício que permite a passagem dos raios luminosos concentrados pelo condensador. Parafuso Macrométrico – engrenagem indispensável para fazer a focagem. Parafuso Micrométrico – elemento que permite movimentos de amplitude reduzida para completar a focagem. Revólver – peça giratória adaptada à zona inferior do tubo que suporta as objetivas de diferentes ampliações (ex: 10x, 40x, 100x) 31/03/2017 Microbiologia 2013/2014

Microscópio ótico - Parte ótica Sistema de Oculares e Sistema de Objetivas – o conjunto de lentes que permitem a ampliação do objecto (a ampliação dada ao microscópio é igual ao produto da ampliação da objetiva pela ampliação da ocular) Fonte Luminosa lâmpada (iluminação artificial), espelho que reflita a luz solar (iluminação natural). Condensador – conjunto de lentes convergentes que distribui regularmente, sobre o campo visual do microscópio, a luz emitida pela fonte luminosa. Diafragma – regula a intensidade luminosa no campo visual do microscópio 31/03/2017 Microbiologia 2013/2014

Utilização do microscópio Ligar a lâmpada Ajustar distância interpupilar (oculares) Colocar a lâmina na platina e focar em objetiva 10x Ampliar a imagem, retificar focagem e observar Utilizar óleo de imersão (1 gota) apenas para a objetiva 100x Limpar a objetiva com solução apropriada Quando terminar observação: Regular a luz para o mínimo e desligar a lâmpada Voltar sempre para a objetiva de menor ampliação Cobrir o microscópio 31/03/2017 Microbiologia 2013/2014

Objetivos P1: O aluno deve ser capaz de: seguir todas as regras de segurança referidas; definir desinfeção, assepsia e esterilização; enumerar os principais processos de esterilização de material e meios de cultura; descrever as situações específicas em que deve ser utilizado um determinado método de esterilização; descrever o modo de atuação dos métodos de esterilização; utilizar o microscópio da forma mais correta. 31/03/2017 Microbiologia 2013/2014