Imobilização de Enzimas JANAINA DUARTE BAUMER SIANNAH MARIA MAS DIEGO Prof. Agenor Furigo Jr. Setembro/2008

Imobilização de Enzimas O principal interesse em imobilizar uma enzima é obter um biocatalisador com atividade e estabilidade que não sejam afetadas durante o processo.

Imobilização de Enzimas Os processos de bioconversão enzimática têm sido bastante utilizados na produção, transformação e valorização de matérias-primas. Reações Enzimáticas Reatores Batelada Custos operacionais Baixa Produtividade Problemas de Remoção da E Variação na Qualidade dos Produtos Desvantagens

Imobilização de Enzimas Visando a obtenção de reações com: > uniformidade tecnológica viabilidade econômica, Utilização de Enzimas na Forma Imobilizadas

Enzimas Livres x Imobilizadas Instabilidade Rápida perda da atividade catalítica Não regeneração Imobilizadas Reutilização Maior estabilidade (Faixas mais amplas de pH e Temp.) Menor interferência de inibidores e/ou ativadores

Métodos de Imobilização Existem duas principais técnicas: Modificação química da molécula: + Substrato não sofre impedimento estérico pela matriz - Pode ocorrer ligação através do sítio ativo tornando-se inativa Ligação física da enzima em uma matriz inerte: + Maior velocidade de reação e facilidade no preparo - Impedimento estérico da molécula de substrato

Métodos de Imobilização Métodos para Imobilização de Enzimas Confinamento Ligação em Suportes Sólidos - Adsorção (carvão ativo) - Ligação Covalente (celulose, sílica) - Ligação Iônica (celulose) Matriz Microcápsula Cápsula

Métodos de Imobilização 1. Imobilização por inclusão (Confinamento): Retidas na rede tridimensional de um polímero insolúvel na água; Aprisionadas no interior de cápsulas ou microcápsulas delimitadas por uma membrana semipermeável; Não é estabelecida ligação química ao suporte e conserva a sua integridade molecular. 1.1 Inclusão em uma matriz; 1.2 Encapsulação; 1.3 Microencapsulação.

Métodos de Imobilização 1.1 Inclusão em uma matriz; Em linhas gerais consiste no aprisionamento das moléculas de enzimas entre as malhas de um polímero geliforme.

Métodos de Imobilização 1. 1.1 Inclusão em uma matriz; Simples ligação física entre enzima e suporte; Nesse caso não há risco de desnaturação, pois não são empregados reagentes químicos, As limitações difusionais são intensas.

Métodos de Imobilização 1. 1.1 Inclusão em uma matriz; Matriz Polímeros sintéticos Silicone, Poliuretano, Nylon,… Polissacarídeos Alginato, Quitosana, Pectina,… Proteínas Colágeno, Gelatina Albumina,…

Métodos de Imobilização 1.2 Encapsulamento: A enzima é imobilizada no interior de esferas, cujo envoltório é constituído por um polímero geliforme e semipermeável. E E E E E E

Métodos de Imobilização 1.2 Encapsulamento: Enzima em uma solução aq.de Na Solução aq. contendo íon bivalentes (Ca2+) Gotejada E E Forma-se uma esfera, dentro da qual as E ficam retidas (membrana = polímero de alginato de Ca) Quando a gota de alginato de Na entra em contato com a sol. salina E E

Métodos de Imobilização 1.3 Microencapsulamento Consiste na preparação de um sist. emulsionado, onde a enz. está confinada no interior das micelas. Não se pode encapsular enz. que destruam a matriz polimérica. Enz. hidrolíticas não são adequadas para o encapsulamento, pois seu substrato de interesse geralmente é de alto peso molecular. Polimerização provoca desativação da enzima

Métodos de Imobilização 1.3 Microencapsulamento Solução aq. de enzima Hexametilenodiamina Cl. de sebacila Fase orgânica Emulsificante Resultante da polimerização da diamina com cl. de sebacila Obtém-se as gotículas da solução enzimática envolvidas por uma película semi-permeável

Métodos de Imobilização 1.3 Microencapsulamento

Métodos de Imobilização Vantagens e incovenientes dos métodos de inclusão: Convêm a quase todos os tipos de enzimas; Restrição pelos fenômenos de impedimento estérico e de difusão através do gel ou da membrana.

Métodos de Imobilização 2. Fixação das enzimas sobre suporte sólido: A enzima deve ser fixar tão solidamente quanto possível; Bentonita: Insolúvel em água, mas uma vez hidratada intumesce e abre-se como uma espoja altamente porosa e carregada magnéticamente. 2.1 Fixação por adsorção 2.2 Fixação das enzimas por ligações covalentes

Imobilização de Enzimas 2.1. Adsorção Consiste da união entre a enz. e um suporte inerte através de interações iônicas, adsorção física, ligações hidrofóbicas e forças atrativas de Van der Waals. Suportes: Derivados da DEAE-celulose, Dowex Orgânicos Inorgânicos Celite, bentonita e alumina

Métodos de Imobilização 2.1 Fixação por adsorção Trata-se de um método simples, de aplicabilidade generalizada. Efetua-se por simples mistura da enz. com o suporte, mas condições de pH e força iônica adequados, em seguida lava-se a enz. que não ficou ligada. Suportes: Carvão ativado, óxidos metálicos, vidros, resinas poliméricas.

Métodos de Imobilização 2.1 Fixação por adsorção Diferentes parâmetros vão influenciar na quantidade de enz. fixada e solidaridade das ligações: Do pH do meio dependem o número e a natureza das cargas sustentadas pelo suporte. Sais em [ ] aumentam a solubilidade das enz. Com da T existe a probabilidade de se aumentar a criação de ligações

Métodos de Imobilização 2.1 Fixação por adsorção Vantagens: Procedimento extremamente simples custos Ligação ocorre por simples exposição e as condições são brandas Os efeitos difusionais são despresíveis Desvantagens: Enz. são altamente dependentes de pH, solventes, substrato e Temp. Podem ser facilmente dessorvidas com a alteração destes parâmetros * É uma das técnicas mais usadas.

Métodos de Imobilização 2.2 Fixação por formação de ligações covalentes A enz. é ligada ao suporte inerte mediante ligações químicas covalentes, que são, normalmente, estabelecidas entre os aminogrupos primários e o anel fenólico dos aa constituintes da enz. com os grupos reativos do suporte (-CHO;-NCS, dentre outros).

Métodos de Imobilização 2.2 Fixação por formação de ligações covalentes Em geral, as reações são feitas em meio aquoso, à Temp. entre 0°C e 25°C e o pH próximo à neutralidade A escolha das condições irá depender da estabilidade da enz. e do suporte frente ao pH de formação das ligações covalentes, assim como a estabilidade das ligações suporte-enzima frente ao pH de utilização do sistema imobilizado.

Métodos de Imobilização 2.2 Fixação das enzimas por ligações covalentes Vantagens: Maior eficiência e estabilidade. Não são tão suscetíveis a pH, força iônica, solventes e Temp. Os suportes são escolhidos por suas propriedades de solubilidade, grupos funcionais, estabilidade mecânica, área superficial, intumescimento e natureza hidrofílica ou hidrofóbica. Suportes: inorgânicos, polímeros naturais e sintéticos.

Métodos de Imobilização 2.2 Fixação das enzimas por ligações covalentes Suportes: Vidro; Sílica; Sephadex; Celulose; Nylon; Poliestireno.

Imobilização de Enzimas Efeitos causados pela imobilização Ao se agregar uma E a um material inerte, por mais suave que seja o procedimento, é razoável esperar algum tipo de efeito sobre sua atividade catalítica.

Imobilização de Enzimas Efeitos causados pela imobilização

Imobilização de Enzimas Interferência da imobilização sobre a atividade catalítica da E. Tabela 3. Características cinéticas e parâmetros termodinâmicos para a invertase nas formas solúvel e insolúvel

Imobilização de Enzimas Interferência da imobilização sobre a atividade catalítica da E. Tabela 3. Características cinéticas e parâmetros termodinâmicos para a invertase nas formas solúvel e insolúvel

Imobilização de Enzimas Interferência da imobilização sobre a atividade catalítica da E. Tabela 3. Características cinéticas e parâmetros termodinâmicos para a invertase nas formas solúvel e insolúvel

Imobilização de Enzimas Dentre os vários efeitos que a imobilização pode causar salienta-se: Modificação da estrutura tridimensional Efeitos estéricos e de conformação Efeitos de Microambiente Efeitos difusionais Resistência difusionais externas Efeitos difusionais internos

Imobilização de Enzimas Efeitos estéricos e de conformação Quando a enz. é ligada ao suporte, pode sofrer alguma mudança na conformação, o que poderá abalar sua eficiência catalítica. O processo de interação enz. suporte é quase sempre aleatório, poderá suceder que a região do sitio ativo se torne menos acessível ao substrato (impedimento estérico).

Imobilização de Enzimas Efeitos de microambiente Quando a E é ligada a um suporte inerte, ela vai ficar sujeita a uma circunvizinhança algo ≠ do que quando esta livre. Esse fato poderá se refletir sobre os valores dos parâmetros cinéticos. Os efeitos da circunvizinhança, que dependem da natureza física e química do suporte, podem acarretar uma distribuição desigual do substrato, produto e cofatores entre a região vizinha do sist. imobilizado e o resto da solução.

Imobilização de Enzimas Efeitos de microambiente O comportamento cinético de uma enzima presa a um suporte carregado pode diferir daquela apresentado pela enzima livre.

Imobilização de Enzimas Efeitos Difusionais Quando a E é imobilizada sobre ou dentro de um suporte sólido, o substrato deve se difundir do seio da solução até o sitio ativo da E. Se a velocidade de difusão do substrato é < que a veloc. de transformação pela E = a veloc. observada é mais baixa do que a esperada, visto que nem todas as moléculas de E estarão em contato com o substrato, (atingem a saturação).

Imobilização de Enzimas Efeitos Difusionais Resistência difusionais externas Surgem devido ao fato de que o substrato deve ser transportado do seio da solução até a superfície de catálise Efeitos difusionais internos Surgem devido à movimentação do substrato no interior do meio catalítico poroso

Propriedades de Enzimas Imobilizadas Medida da atividade: Atividade residual de E imobilizada é mais fraca que a das E nativa, mas a estabilidade é maior Influencia das condições operacionais: pH e T  desnaturação parcial ou total da proteína; Imobilizada  resistem melhor a variações de pH e tratamentos térmicos;

Imobilização de Enzimas Vantagens As enzimas podem ser reutilizadas Os processos químicos podem ser continuamente operados e prontamente controlados Os produtos podem ser facilmente separados Os problemas de efluentes são minimizados A repetibilidade do processo pode ser aumentada estabilidade custos

Imobilização de Enzimas Desvantagens Aleatoridade da interação enzima-substrato; Inexistência de um método geral de imobilizacao; Atividade catalítica devido a efeitos: Microambiente Difusionais Estéricos / Conformacionais

Imobilização de Enzimas Tipos de Suporte Existem inúmeros materiais inertes que podem ser usados. A natureza física desses suportes pode variar, desde materiais geliformes até superfícies sólidas (pérolas de vidros) recobertas com alguma substância capaz de interagir com a E. A escolha do método de imobilização e do tipo de suporte dependerá, essencialmente, de dois fatores: - das características peculiares da E - das condições de uso da E imobilizada

Imobilização de Enzimas Tipos de Suporte Não existe um método geral de imobilização e nem um suporte universal. Geralmente as condições de imobilização para uma E só poderam ser estabelecidas empiricamente. Vários Suportes e Diferentes Métodos Enzima Imobilizar Escolher o suporte e o método que apresentam > atividade Avaliar a Atividade do Sistema

Imobilização de Enzimas Tipos de Suporte Tabela 1. Classificação de suportes inertes.

Imobilização de Enzimas Tipos de Suporte Tabela 2. Atividade da esterase de Bacillus subtilis imobilizada em vários suportes e por diferentes métodos.

Imobilização de Enzimas Tipos de Suporte

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Imobilização de Enzimas Exemplo 1: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE LIPASES IMOBILIZADAS EM GEL DE PECTINA (Santos et al.,1997). Foi realizado um estudo sobre a atividade de diferentes lipases (lipases de Candida rugosa, Pseudomonas cepacia, Mucor javanicus e Lipolase) imobilizadas em gel de pectina, avaliando sua atividade catalítica em meio orgânico.

Imobilização de Enzimas A pectina  heteropolissacarideo que formar géis em presença de cátions Preparo do gel de pectina: 9 mL de uma solução tampão fosfato, pH 7,2 0,8 g de pectina cítrica Sol. Aq. de E aquecida até a completa dissolução esfriada a 40°C agitada vigorosa e deixada esfriar a T ambiente.

Imobilização de Enzimas Foi avaliado a atividade das E imobilizadas neste gel através da reação de esterifcação do ác. láurico com o n-pentanol. Foram utilizados quantidades equimolares dos substratos (0,01 mol). As reações foram realizadas em uma incubadora sob agitação a 25°C. formar um sist. rígido e estável Gel de pectina Sol. Cl. Cálcio Removidos para um erlenmeyer contendo 25 mL de hexano. Cortados em peq. cubos de 125 mm3

Imobilização de Enzimas Tabela 1– Rendimentos para a reação de esterificação do ác. láurico com o n-pentanol catalisada por diferentes lipases imobilizadas em gel de pectina.

Imobilização de Enzimas Tabela 1–Rendimentos para a reação de esterificação do ácido láurico com o n-pentanol catalisada por diferentes lipases imobilizadas em gel de pectina.

Imobilização de Enzimas Lipases de Candida rugosa com diferentes AE e procedências (Amano e Sigma), foram imobilizadas no gel de pectina, nas mesmas condições descritas anteriormente variando-se a [ ] de enzima.

Imobilização de Enzimas Lipases de Candida rugosa com diferentes AE e procedências (Amano e Sigma), foram imobilizadas no gel de pectina, nas mesmas condições descritas anteriormente variando-se a [ ] de enzima. Quanto > a [Enz.] > o rendimento

Imobilização de Enzimas Lipases de Candida rugosa com diferentes AE e procedências (Amano e Sigma), foram imobilizadas no gel de pectina, nas mesmas condições descritas anteriormente variando-se a [ ] de enzima.

Imobilização de Enzimas Estes resultados demonstram: Que quando E são imobilizadas por métodos de envolvimento, a quantidade de biocatalisador e AE são fatores importante para uma catálise + eficiente, uma vez que as reações ocorrem por difusão dos substratos no gel. Viabilidade do uso do gel de pectina como suporte para a imobilização de enzimas e sua aplicação em meio orgânico.

Imobilização de Enzimas Exemplo 2: Determinação das propriedades catalíticas em meio aquoso e orgânico da lipase de Candida rugosa imobilizada em celulignina quimicamente modificada por carbonildiimidazol (Fabrício M. Gomes; Ariela V. de Paula; Grazielle dos S. Silva; Heizir F. de Castro; 2006)

Imobilização de Enzimas Imobilização da lipase em celulignina O suporte foi inicialmente neutralizado pela adição de uma sol. de hidróxido de sódio (0,1 M) e, em seguida, tratado com carbonildiimidazol diluído em dimetilsulfóxido (5 mg/mL). A imobilização consistiu do contato da sol. enzimática (250 U) com o suporte previamente umedecido com hexano na presença de polietilenoglicol por 21 h. A enzima imobilizada foi recuperada por filtração a vácuo e o sistema lavado com hexano gelado para redução do teor de água.

Imobilização de Enzimas Propriedades catalíticas da lipase livre e imobilizada em meio aquoso A atividade enzimática da lipase nas formas livre e imobilizada foi determinada pelo método de hidrólise do azeite de oliva. Para verificar as alterações causadas nas propriedades originais da lipase livre, foi determinada a influência do pH e da T na AE das lipases livre e imobilizada, bem como estimados os parâmetros cinéticos.

Imobilização de Enzimas  Influência do pH imobilização deslocou o pH ótimo da enz. livre, para um valor de pH + básico.

Imobilização de Enzimas  Influência do pH Mudanças conformacionais da enz. ou alterações de [ ] entre as espécies carregadas, substrato, produto, íons H, íons OH, tanto no microambiente da enz. imobilizada quanto no meio reacional (macroambiente).

Imobilização de Enzimas  Influência da Temperatura A imobilização parece conferir alguma proteção à enzima

Imobilização de Enzimas  Influência da Temperatura Imobilização: Tótima, o que permite operações em uma faixa > de T. O da Tótima deve-se à ligação da E ao suporte, impedindo o desdobramento da estrutura terciária.

Imobilização de Enzimas  Parâmetros cinéticos Nas Figuras 3 e 4 são apresentadas as atividades da lipase livre e imobilizada, respectivamente, em função da [ ] de ácidos graxos presentes na emulsão óleo e água contendo diferentes proporções de azeite de oliva (10-50% m/v).

Imobilização de Enzimas  Parâmetros cinéticos

Imobilização de Enzimas  Parâmetros cinéticos Cinética do tipo Michaelis-Menten Sem inibição por P ou redução do teor de água no meio reacional

Imobilização de Enzimas As constantes de afinidade pelo substrato (Km) e a Vmax de reação foram calculadas com auxílio do programa Enzyme Fitter.

Imobilização de Enzimas As constantes de afinidade pelo substrato (Km) e a Vmax de reação foram calculadas com auxílio do programa Enzyme Fitter. Mediante imobilização, a afinidade da lipase pelo substrato foi . Esse comportamento se deve à < transferência de massa do meio reacional para o sist. imobilizado, pois o processo de imobilização reduz a difusão do substrato nos interstícios do suporte

Imobilização de Enzimas Este é um perfil típico dos sistemas imobilizados, tendo em vista que a E livre exerce sua atividade catalítica em um meio homogêneo, enquanto a E imobilizada em um suporte sólido deve agir em um meio heterogêneo. O da atividade das enzimas imobilizadas às mudanças conformacionais na sua estrutura terciária impedimentos estéricos.

Imobilização de Enzimas Testes de estabilidade Estabilidade à estocagem A lipase imobilizada foi estocada a uma temperatura de 4 ºC por 90 dias.

Imobilização de Enzimas Testes de estabilidade Estabilidade à estocagem A lipase imobilizada foi estocada a uma temperatura de 4 ºC por 90 dias. Estável por 30 dias

Imobilização de Enzimas  Estabilidade térmica

Imobilização de Enzimas  Estabilidade térmica 97% 60%

Imobilização de Enzimas  Estabilidade térmica 37% 9%

Imobilização de Enzimas Exemplo 3: Imobilização de Lipase de Candida antarctica B em Esferas de Quitosana para Obtenção de BiodieseI por Transesterificação de Óleo de Mamona (Cruz Jr., Américo; Pacheco, Sabrina Moro Villela; Furigo Jr, Agenor; 2008)

Imobilização de Enzimas Produção de biodiesel  transesterificação (reação química dos ác. graxos contidos nos óleos vegetais ou gorduras animais com o etanol ou o metanol estimulado por um catalisador - ácidos, básicos ou enzimáticos). Indústrias químicas utilizam a catálise básica. Esse processo possui vários inconvenientes como a baixa seletividade do catalisador, levando a indesejáveis reações paralelas. Considerados como “not ecologically friendly” Suas desvantagens impulsionaram a pesquisa por novos catalisadores  lipases.

Imobilização de Enzimas As lipases ( EC 3.1.1.3) catalisam a hidrólise e a síntese de ésteres formados a partir do glicerol e ác. graxos de cadeias longas.

Imobilização de Enzimas As lipases ( EC 3.1.1.3) catalisam a hidrólise e a síntese de ésteres formados a partir do glicerol e ác. graxos de cadeias longas. Lipase Livre Inviável perdem atividade em condições e meios desnaturantes Biopolímero imobilizadas em suportes sólidos, que lhes conferem > resistência e facilitam sua recuperação Quitosana a vida útil

Imobilização de Enzimas Otimização do processo de ativação: O processo de ativação das esferas de quitosana consistiu em adicionar 2mL de soluções de glutaraldeído 0, 1, 3, 5, 7 e 9% (v/v) em 30 esferas de quitosana (período de incubação de 24 h à 25oC). Através dos resultados obtidos, foi possível observar que ocorreu uma significativa queda na AE do sobrenadante, quando a sol. enzimática foi incubada com esferas ativadas com solução de glutaraldeído 3%.

Imobilização de Enzimas Quando a molécula da E está ligada a um suporte, ela precisa conservar suas distâncias intermoleculares o que torna sua conformação + rígida = + resistente a mudanças conformacionais induzidas por ag. desnaturantes. No entanto, quando a [ ] de glutaraldeído usada é muito alta, uma quantia > de grupos aldeídos reage com um número > de resíduos da E tornando sua estrutura muito rígida, com conseqüente distorção de sua conformação = a perda de atividade. Necessidade da otimização do processo de imobilização da E nas esferas de quitosana

Imobilização de Enzimas Caracterização das E imobilizada comercialmente: Análise de AE em ≠ pHs (3,0 - 10,0 a 25oC) e temp. (25 - 100oC em pH 9,0). Os estudos relacionados ao perfil de atividade x pH e atividade x temp., revelaram que: CALB L  pH 5,0 e 100ºC, NOVOZYM® 435  pH 9,0 e 100ºC

Imobilização de Enzimas A reação de transesterificação para a produção do biodiesel foi realizada através da incubação do óleo de mamona e etanol na razão 3:1 juntamente com 3% m/m de E em um reator tipo batelada, de 0,5 L. Na reação de transesterificação com o óleo de mamona e o etanol, foi possível observar uma eficiente taxa de conversão de triglicerídeos para seus respectivos ésteres etílicos.